一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，包括步骤为：接种受体菌，在LB固体培养基上划线，获取单克隆；将单克隆至培养基中，摇床上振荡培养；当振荡培养浑浊后，测定溶液的OD

【技术实现步骤摘要】
一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法


[0001]本专利技术涉及生命科学和基础医学科研领域，特别是涉及一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]在自然条件下，很多质粒都可通过细菌结合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
[0003]转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2， RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
[0004]进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
[0005]目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，虽然RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率已可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于
‑
80℃下保存，能保存半年，因此CaCl2法使用更广泛。
[0006]但是在CaCl2制备方法中，感受态细胞产品的转化效率还存在着巨大的进步空间，距离国际水平存在明显差距，尤其从转化效率上看，使用pUC19质粒DNA 检测，目前我国市场上的感受态细胞产品转化效率多数不足10^8cfu/μg DNA，仍需要不断进步。

技术实现思路

[0007]本专利技术主要解决的技术问题是提供一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，其优点是能快速制备，转化效率更高，更加稳定，广泛适用于基础科研领域，提高科研人员实验效率。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，包括步骤为：
[0009]步骤1：接种受体菌，在LB固体培养基上划线，获取单克隆；
[0010]步骤2：将单克隆至培养基中，摇床上振荡培养；
[0011]步骤3：当振荡培养浑浊后，测定溶液的OD
600
值；
[0012]步骤4：对溶液冷却、离心，收集第一沉淀；
[0013]步骤5：采用缓冲液将所述第一沉淀重悬得到重悬液，并冷却；
[0014]步骤6：再对重悬液离心，收集第二沉淀；
[0015]步骤7：采用缓冲液将所述第二沉淀重悬；
[0016]步骤8：滴加二甲基亚砜，冷却，得到感受态细胞；
[0017]步骤9：将所述感受态细胞冷冻保存。
[0018]在本专利技术一个较佳实施例中，将制备的感受态进行分装，并迅速在液氮中冷冻。最终将其放置在
‑
80℃长期保存。
[0019]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤2中所述振荡培养的温度为20
‑
25℃，时间为20
‑
48小时。
[0020]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤2中所述培养基为包括细菌培养用胰化蛋白胨和酵母混合而成的培养基，所述细菌培养用胰化蛋白胨的浓度为3
‑
5％ w/v，所述酵母的浓度为0.4
‑
0.7％w/v。
[0021]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤2中所述培养基的制备过程为将胰化蛋白胨、酵母、氯化钠和氯化钾混合，加压蒸汽灭菌，再加入氯化镁和硫酸镁制得培养基。
[0022]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤3中，当溶液的OD
600
值为0.5
‑
0.7时，将溶液取出冷却。
[0023]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤4中所述离心是在转速为2300
‑
2600g下，溶液离心8
‑
11分钟。
[0024]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤5中所述缓冲液为包括哌嗪
‑
1,4
‑
二乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的水溶液，所述缓冲液的pH值为6.4
‑
6.7，所述哌嗪
‑
1,4
‑
二乙磺酸的浓度为7
‑
15mM，所述氯化钙的浓度为25
‑
33mM，所述氯化钾的浓度为210
‑
300mM，所述氯化锰的浓度为50
‑
60mM。
[0025]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤6中所述离心是在转速为2300
‑
2600g下，重悬液离心7
‑
9分钟。
[0026]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤8中滴加至所述二甲基亚砜的体积浓度为5
‑
9％。
[0027]在本专利技术一个较佳实施例中，步骤9中所述冷冻是在液氮中冷冻的，所述保存是在
‑
80℃下长期保存。
[0028]本专利技术的有益效果是：本专利技术的获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，经过特殊工艺处理得到的感受态细胞，使用pUC19质粒DNA检测，转化效率可达5*10^9cfu/μg DNA。将得到的感受态细胞放置在
‑
80℃的温度环境下，保存半年转化效率都不会发生改变，质量稳定，使用方便，可以极大程度降低科研人员的实验成本，提高研究效率。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
[0030]图1是本专利技术所述获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法的步骤1
‑
3的示意图；
[0031]图2是本专利技术所述获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法的步骤4
‑
9的示意图。
具体实施方式
[0032]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0033]实施例一：
[0034]请参阅图1和图2，提供一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤为：步骤1：接种受体菌，在LB固体培养基上划线，获取单克隆；步骤2：将单克隆至培养基中，摇床上振荡培养；步骤3：当振荡培养浑浊后，测定溶液的OD
600
值；步骤4：对溶液冷却、离心，收集第一沉淀；步骤5：采用缓冲液将所述第一沉淀重悬得到重悬液，并冷却；步骤6：再对重悬液离心，收集第二沉淀；步骤7：采用缓冲液将所述第二沉淀重悬；步骤8：滴加二甲基亚砜，冷却，得到感受态细胞；步骤9：将所述感受态细胞冷冻保存。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述振荡培养的温度为20
‑
25℃，时间为20
‑
48小时。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述培养基为包括细菌培养用胰化蛋白胨和酵母混合而成的培养基，所述细菌培养用胰化蛋白胨的浓度为3
‑
5％w/v，所述酵母的浓度为0.4
‑
0.7％w/v。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述培养基的制备过程为将胰化蛋白胨、酵母、氯化钠和氯化钾混合，加压蒸汽灭菌，再加入氯化镁和硫酸镁制得培养基。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，当溶液的OD
600
值为0.5
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲红金，吕妍，万兵兵，曹禺，汪子喻，覃佐菊，李俊实，
申请(专利权)人：上海佐润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：