使用微粒去除非特异性结合信号的方法技术

通过利用捕获微粒和对照微粒去除非特异性结合信号来准确检测样品中的一种以上分析物的方法和试剂盒。捕获微粒可以与分析物特异性结合；对照微粒不与分析物特异性结合，但与背景分子结合。在合适的条件下将捕获微粒和对照微粒均添加到样品中，使分析物和微粒结合。然后添加检测剂以结合分析物和被微粒捕获的其他物质。然后使微粒通过基于细胞计数的检测方法，其中，来自捕获微粒和对照微粒的检测信号被区分。获得来自捕获微粒和对照微粒的检测信号之间的差异，然后基于先前确定的此种差异与已知量的分析物之间的关系，确定分析物的存在和/或量。在和/或量。在和/或量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用微粒去除非特异性结合信号的方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2019年2月21日提交的美国临时申请号62808746的优先权，其公开内容通过整体并入本文。

技术介绍

[0003]生物样品中化学和生物靶标(分子或微生物)(例如血液、血浆、血清、尿液、唾液和各种粘膜分泌物、鼻咽和口咽拭子、呼吸道痰液以及细胞和组织裂解物)的准确检测和定量对于快速准确诊断各种疾病、疾病状况监测、医疗监测以及确定适当治疗方案很重要。在许多情况下，被检测或量化的靶标少量地存在于生物样品中，并且通常与大量不相关或干扰的成分混合。此类靶标或分析物的准确检测需要高度灵敏和特异性的测试方法，例如配体结合测定(Ligand binding assay，LBA)。
[0004]灵敏度和特异性是任何基于配体结合测定检测平台的两个关键要素。“分析灵敏度”表示样品中可通过测定准确测量的最小的分析物的量。“分析特异性”指测定法测量样品中一种特定分析物而非其他分析物的能力。理论上，灵敏度和特异性是二元分类测试性能的统计量度，在统计学中也称为分类函数：灵敏度(在某些领域也称为真阳性率、召回率或检测概率)衡量被正确识别为阳性的比例(例如，被正确识别为患有此种疾病的病人的百分比)。特异性(也称为真阴性率)衡量被正确识别为阴性的比例(例如，被正确识别为没有疾病的健康人的百分比)。简言之，灵敏度是实际测试为阳性的真阳性的比例，灵敏度测试很少会“错过”阳性个体；特异性是实际测试为阴性的真阴性的比例，特异性测试不会产生假阳性。由于缺乏灵敏度和/或特异性，分析方法可能无法准确检测分析物。一方面，特异性方法可能缺乏足够的灵敏度来检测少量的目标分析物；另一方面，由于背景信号，灵敏性方法可能缺乏特异性。
[0005]配体结合测定(LBA)是一种分析检测程序，它依赖于配体分子与受体、抗体或其他大分子的结合。检测方法用于确定所形成的配体
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受体复合物的存在和程度，这通常通过电化学或荧光检测方法来确定。此种类型的分析测试可用于测试样品中已知与受体结合的目标分子的存在。典型的配体结合测定将一个结合伴侣(binding partner)锚定在固体表面，因此称为固相配体结合测定，包括多孔板分析(例如ELISA)、珠上(on
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bead)配体结合测定、柱上(on
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column)配体结合测定、过滤测定、表面等离子体共振测定(Biacore)和基于平衡法(equilibrum
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based)的测定。尽管配体结合测定具有高度特异性，但多种因素(包括抗体亲和力、相互作用物的价态、测定形式、测定程序变异性和基质效应)通常会限制特定方法的灵敏度和特异性。
[0006]生物样品(例如血清)含有背景结合成分，包括天然抗体、类风湿因子和许多其他阻止对样品中分析物进行准确分析的基质因素。测试样品中的背景结合因子可能会使样品中目标分析物的检测和定量复杂化。
[0007]背景信号会影响测定的灵敏度和特异性，因为它们会导致假阳性或假阴性结果，具体取决于检测分界点(cut point)的设置方式。如图1所示，当来自分析物的检测信号远
高于背景信号时，该组分界点仅影响定量而不影响检测为靶标的阳性(图1C)。然而，当目标信号低时，不同组的分界点导致分析物信号被视为完全相反的结果(阴性或阳性)(图1A和1B)。分界点设置的此种不确定性会干扰对危及生命的疾病的准确诊断，例如疾病早期的生物标志物、低水平的传染性物种和低水平的过敏原特异性IgE等。
[0008]背景结合有许多原因，包括测试样品或检测溶液中与基质结合并导致标记的检测剂与非预期目标的基质结合的任何因素。结合可以是结合到容器的表面位点或结合到未被预期目标覆盖的捕获剂部分或结合到与结合链复合物的任何部分结合的非预期检测剂。
[0009]几乎所有基于固相的测定均会受到基质结合效应的影响，包括ELISA和基于微珠(bead)的测定。基质中除分析物之外的成分可以与固体表面相互作用并干扰测定结果。例如，如果测试样品中存在大量分析物相关成分(例如，天然抗体、IgG)，则该成分可以以剂量依赖性方式与固体表面非特异性结合并且(如果测试形式中使用分析物的抗Ig检测剂)可被检测到。血清/血浆成分可能会影响测定结果，通常需要稀释患者样本进行检测以尽量减少此种影响。
[0010]测定变异性来自系统变异性，包括物理分离的容器、复杂的测定程序以及样品变异性，包括样品基质和分析物浓度。
[0011]在典型测定程序中，变异性可能来自样品处理、样品稀释、温度、移液、试剂添加顺序、孵育时间、洗涤周期等任何步骤。所有这些因素均会增加测定结果的不确定性。
[0012]导致非特异性结合的另一个因素是分析物与固体表面的非特异性结合，即不是与特异性分析物捕获分子结合，而是直接与表面位点结合，导致剂量依赖性非特异性信号。
[0013]背景结合原因的复杂性使得很难根据正常/阴性对照简单地扣除或去除背景信号，因为每个样本均有其独特的背景成分。
[0014]有两种常见的策略可以克服配体结合测定的背景信号：1)减少背景结合；和2)基于“阴性”对照建立分析分界点。这两种策略会影响不同方向的分析灵敏度和特异性。
[0015]对于ELISA平台，常使用空白对照和/或不相关分子作为与测试样品相同板的孔的对照，检测生物样品中的分析物，以确定板特异性分界点(系统分界点)。由于OD的读数范围有限和物理限制，ELISA方法具有所有潜在的基质结合效应，因此ELISA测定通常需要将样品稀释到一定程度，不仅要稀释背景结合，还要将分析物稀释到窄窗口的检测范围。这会降低测定灵敏度。具有多重微珠测定的现有技术可以同时检测来自一个以上样品的许多属性。由于检测剂是荧光标记试剂，检测范围很广。这直接导致了广泛的检测范围和许多筛选设计，因此不需要稀释样品。然而，基于微珠的检测具有与ELISA检测相同的背景结合问题。市售试剂盒中有背景信号的报告，因为在阴性对照微珠上发现了强信号。已努力阻止这些信号，包括从样品中预吸附类风湿因子或对微珠进行特殊处理。这些方法通常很昂贵，且不能完全去除阴性对照微珠上的背景信号。
[0016]为了减少生物测定(例如ELISA、Western Blot、基于微珠的测定或其他基于固相的测定，包括微芯片和immunoCap)中的背景结合，通过使用非特异性结合的阻断材料(例如BSA)“预先占据”固相上那些潜在的结合位点，可以大大减少检测剂的非特异性结合。有时从基质中预吸附(消耗)干扰因子，例如，使用蛋白A/G预处理降低测试血清中的IgG水平有助于检测特定的IgM和IgE抗体。然而，此种非特异性阻断材料通常不能完全阻断非特异性结合位点，典型结合缓冲液中BSA的百分比为0.1％至10％不等。高浓度阻断剂(10％)可能
会阻止或干扰检测分析物与固定在固相(例如ELISA板或微珠表面)上的配体的预期特异性结合。在其他情况下，检测剂甚至可能与BSA发生反应。在血浆和血清样品中，背景结合与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.检测样品中可能存在的N种目标分析物的方法，N为等于或大于1的自然数，其中，所述方法包括：(a)针对N种目标分析物中的每种分析物，向生物样品中加入多对微粒，从而形成混合物，每对微粒包括(1)捕获微粒和(2)相应的对照微粒；每个捕获微粒包含第一基底和偶联在第一基底上的至少一种捕获剂，所述捕获剂具有活性且能够与分析物特异性结合；每个对照微粒包含第二基底，所述第二基底不与能够特异性结合分析物的活性捕获剂偶联；(b)针对N种目标分析物中的每种分析物，向所述混合物中加入能够结合分析物的检测剂；(c)在流式细胞仪的单个文件中比对和通过N种目标分析物中的每种分析物的每个微粒，同时检测(1)与微粒结合的检测剂产生的检测信号和(2)微粒中基底发出的内参信号；所述捕获微粒与相应对照微粒的内参信号彼此不同，且各自不同于检测信号；(d)针对N种目标分析物中的每种分析物，基于检测到的不同内参信号，区分来自捕获微粒的检测信号和来自相应对照微粒的检测信号；(e)针对N种目标分析物中的每种分析物，由获得的捕获微粒的检测信号得到第一加权值，由获得的相应对照微粒的检测信号得到第二加权值，用第一加权值减去第二加权值，得到校准加权值；以及(f)针对N种目标分析物中的每种分析物，基于校准加权值，确定样品中存在或不存在分析物。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测剂包含荧光染料，检测与每个微粒结合的检测剂产生的检测信号包括检测由微粒发出的荧光信号。3.根据权利要求2所述的方法，其中，每个微粒的基底包含荧光染料，检测每个微粒中基底发出的内参信号包括检测由微粒发出的荧光信号。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测剂包含重金属离子标签，检测与每个微粒结合的检测剂产生的检测信号包括在质谱仪中检测代表包含在检测剂中的重金属离子标签的信号。5.根据权利要求4所述的方法，其中，针对N种目标分析物中的每种分析物的每个微粒的基底包含重金属离子标签，针对N种目标分析物中的任一分析物的每对微粒中的重金属离子标签彼此不同且各自不同于检测剂中的重金属离子标签，检测每个微粒中基底发出的内参信号包括在质谱仪中检测代表包含在基底中的重金属离子标签的信号。6.根据权利要求1所述的方法，其中，N种目标分析物中的每种分析物包含对抗原或过敏原具有特异性的抗体或生物素化抗体。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述抗原或过敏原选自：蛋白质、细菌、病毒、细菌成分、病毒成分、毒素、药物、药物赋形剂、花粉、草、灰尘和花生。8.根据权利要求1所述的方法，其中，N种目标分析物中的每种分析物独立地选自：药物化合物、血液中的因子、蛋白质、细菌、细菌成分、病毒、病毒成分、肽、抗体、毒素、激素、细胞因子、免疫球蛋白、免疫球蛋白Fab、多核苷酸、药物、药物载体和药物赋形剂。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包括体液或生物素化体液。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述体液选自：血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、鼻咽和口咽拭子、呼吸道痰液、鼻涕泪液和组织裂解物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述捕获剂包括抗原或抗体。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述抗原选自：蛋白质、肽、细菌、病毒、细菌成分、病毒成分、毒素、激素、细胞因子、药物化合物、血液因子、免疫球蛋白、免疫球蛋白Fab、多核苷酸、药物载体或赋形剂、食物过敏原或季节性过敏原。13.根据权利要求1所述的方法，其中，确定分析物的丰度包括检测分析物的存在或不存在而不量化样品中分析物的量。14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品是从人类个体获得的生物样品，N种目标分析物中的第一分析物是具有已知同种型且对已知抗原具有特异性的人抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁勤学，
申请(专利权)人：丁勤学，
类型：发明
国别省市：