一种产胞外多糖培养基及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产胞外多糖培养基及其应用，所述产胞外多糖培养基组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，18g/L NaCl，18g/L MgCl2，18g/L K2SO4，12g/L甘油，15g/L琼脂，溶剂为水，pH6.8

【技术实现步骤摘要】
一种产胞外多糖培养基及其应用
(一)

[0001]本专利技术属于生物
，特别是涉及一种高产胞外多糖的大肠杆菌培养基，以及培养该细菌产糖的方法。
(二)
技术介绍

[0002]胞外多糖是分泌到细胞外的一类糖类化合物，自从1972年把海洋细菌产生的高分子碳水化合物命名为胞外多糖开始，动物、植物和微生物来源的胞外多糖就受到了广泛的关注、研究和开发。胞外多糖不仅有利于宿主自身的生存，而且具有结构和功能多样化的特性以及天然的生物相容性和无毒性，因而受到了各个研究领域的青睐，在食品工业、农业领域、纺织工业、制药业、化妆品工业、民用工业和石油工业有广泛的应用前景。多糖的开发应用始于几十年前特别是植物和海藻来源的多糖，包括植物来源的纤维素、淀粉和果胶质以及海藻来源的琼脂糖、海藻盐和角叉胶等；细菌胞外多糖因其易分离纯化，而且具备结构新颖和性能特殊的优点，因而具有巨大的开发潜能。此外，细菌胞外多糖的结构多样性、功能多样化也使得胞外多糖的相关研究也越来越受到关注。据研究报道，细菌胞外多糖在保护宿主细胞免受干燥、抵抗抗菌化合物、抵御噬菌体侵染、渗透胁迫及吞噬细胞吞噬，以及表面粘附和生物被膜形成等方面起着非常重要的作用。目前，细菌胞外多糖被广泛用于食品、医药、石化和化妆品等领域。
[0003]过表达基因簇ycjD
‑
fabI
‑
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‑
rnb的重组大肠杆菌EC100在特定培养基中能稳定产生一种胞外多糖，经鉴定其为一种新型的胞外多糖，并且命名为RB多糖。研究发现RB多糖不仅可以被肠道微生物降解而且还影响短链脂肪酸的产生，具有潜在的益生元功效和商业应用价值。
[0004]重组大肠杆菌EC100在常规的实验室培养基如LB上能正常生长但是不能产生RB多糖，在商品化的PIA培养基(假单胞菌分离琼脂培养基)(BD,Sparks,MD)上能稳定产生RB多糖，缺点是PIA培养基成本太高，产量低，不利于其大规模的生产。为了商业化应用RB多糖，前提需要进行大量的生产，因此探索一种廉价和高产RB多糖的培养基是大规模应用的前提。因此，本专利技术基于生产的需要，探索和优化高产RB多糖的培养基。
(三)
技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种产胞外多糖培养基及其产胞外多糖的应用，在PIA培养基的基础上，寻找能够提高胞外多糖产量的无机盐以及碳氮源。同时，为了减少能耗、降低后续纯化的成本和效率，采用固态发酵技术(平板培养法或者固体培养基培养法)，通过生物转化生产RB多糖，从而最终找出廉价、稳定、高产RB多糖的培养基及其培养方法。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：
[0007]本专利技术提供一种产胞外多糖培养基，所述产胞外多糖培养基组成为：5
‑
15g/L蛋白胨，1
‑
10g/L酵母提取物，1.6
‑
20g/L NaCl，2
‑
24g/L MgCl2，2
‑
20g/L K2SO4，6
‑
18ml/L甘油，12
‑
18g/L琼脂，溶剂为水，pH6.8
‑
7.2。
[0008]进一步，优选所述产胞外多糖培养基组成：8
‑
12g/L胰蛋白胨，3
‑
6g/L酵母提取物，15
‑
20g/L NaCl，15
‑
20g/L MgCl2，15
‑
20g/L K2SO4，10
‑
14ml/L甘油，14
‑
16g/L琼脂，溶剂为水，pH6.8
‑
7.2。
[0009]更进一步，优选所述培养基组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，18g/LNaCl，18g/L MgCl2，18g/L K2SO4，12g/L甘油，15g/L琼脂，溶剂为水，pH6.8
‑
7.2。
[0010]本专利技术还提供一种所述产胞外多糖培养基在产胞外多糖中的应用，所述应用为：将重组大肠杆菌RBATCC3
‑
EC100划线接种至所述产胞外多糖培养基中，30
‑
40℃培养10
‑
30h(优选37℃培养24h)，用涂布棒或者刮铲将固体培养基上的菌体和胞外多糖的混合物全部挂下来，用PBS进行重悬；加入3倍体积的无水乙醇(可重复利用)充分混匀，于4℃冰箱沉淀过夜；沉淀后的溶液6000rpm，离心20min；最后将沉淀冷冻干燥成粉末状即为胞外多糖。重组大肠杆菌RBATCC3
‑
EC100是按照专利申请CN106978430 A实施例1方法构建。
[0011]所述重组大肠杆菌RBATCC3
‑
EC100接种前先进行活化培养，所述活化培养为：从
‑
80℃保存的重组大肠杆菌RBATCC3
‑
EC100划线在含50μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养24h后；挑取单菌落至含50μg/ml卡那霉素的3ml LB液体培养基的试管中，置于恒温震荡培养箱中，37℃过夜培养；将菌液按照体积比1：100比例转接至新鲜的含50μg/ml卡那霉素LB液体培养基中继续培养至OD
600nm
＝0.5，再划线接种至产胞外多糖培养基。
[0012]与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：
[0013]本专利技术的产胞外多糖培养基在保证菌株正常生长的同时，还可以让其稳定高产胞外多糖，效率高、可重复性好，优化后的产胞外多糖培养基产糖量提高了2.25倍(优化前为1.093g/L，优化后产糖量为2.46g/L)；操作性强，使用简单，只需要按照培养基的培养比例进行配制固体培养基，然后在固体平板上接种产糖突变株进行培养即可；能耗低，成本低，该专利技术使用的试剂是常规试剂，易于购买和运送，关键使用比较廉价的原材料。
(四)附图说明
[0014]图1为比较LB培养基和PIA培养基上RB多糖产糖情况。A，LB培养基上菌落图；B，PIA培养基上的菌落图；C，LB培养基和PIA培养基上产糖的定量分析。
[0015]图2为PIA培养基各组分对产糖的影响。
[0016]图3为无机盐和甘油对产糖的影响。
[0017]图4为不同浓度氯化钙对RB多糖产生的影响。
(五)具体实施方式
[0018]下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：
[0019]LB液体培养基终浓度组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为水，pH值自然。LB平板为向LB液体培养基添加15g/L琼脂。
[0020]PIA固体培养基终浓度组成为：蛋白胨20g/L，氯化镁1.4g/L，硫酸钾10g/L，三氯生25mg/L，13.6g/L琼脂，甘油20ml/L，溶剂为水，pH值自然。
[0021]本专利技术实施例所用重组大肠杆菌RB本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产胞外多糖培养基，其特征在于所述产胞外多糖培养基组成为：5
‑
15g/L蛋白胨，1
‑
10g/L酵母提取物，1.6
‑
20g/L NaCl，2
‑
24g/L MgCl2，2
‑
20g/L K2SO4，6
‑
18ml/L甘油，12
‑
18g/L琼脂，溶剂为水，pH6.8
‑
7.2。2.如权利要求1所述的产胞外多糖培养基，其特征在于所述产胞外多糖培养基组成：8
‑
12g/L胰蛋白胨，3
‑
6g/L酵母提取物，15
‑
20g/L NaCl，15
‑
20g/L MgCl2，15
‑
20g/L K2SO4，10
‑
14ml/L甘油，14
‑
16g/L琼脂，溶剂为水，pH6.8
‑
7.2。3.如权利要求1所述的产胞外多糖培养基，其特征在于所述产胞外多糖培养基组成为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，18g/L NaCl，18g/L MgCl2，18g...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹业师，李百元，陈丹，曹林艳，陈华海，胡云霏，
申请(专利权)人：湖南科技学院，
类型：发明
国别省市：