一种用于微藻鉴定的引物对及其应用制造技术

本发明专利技术提供了提供一种用于微藻鉴定的引物对，所述引物对的为：cpDNAB2F：5

【技术实现步骤摘要】
一种用于微藻鉴定的引物对及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学及生物信息学，具体的说，涉及一种用于微藻鉴定的引物对及其应用。

技术介绍

[0002]海洋微藻是一群体型微小(2
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30微米)，能进行光合作用的单细胞生物的总称，包括真核和原核两大类，主要有蓝藻门、绿藻门、硅藻门和金藻门等多个门类。微藻种类繁多，高达两万多种，如此庞大数量种类的准确鉴定与分类，是我们面临的一个巨大挑战。现阶段，海洋微藻的种类鉴定主要依赖于在显微镜下，对其形态学的观察。而微藻形态微小且受环境的影响变化较大，并且不同生命周期具有不同的形态特征。形态学鉴定受主观因素的影响较大，耗时且耗力，经典的形态学分类已不能满足微藻资源鉴定与分类的需求。随着分子生物学的飞速发展，利用DNA条形码技术对微藻种类进行快速、准确、有效的鉴定，受到越来越多的青睐。DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
[0003]自Paul Hebert 2003年提出DNA条形码(DNA barcoding)的概念以来，DNA条形码技术已成为系统进化分析和生物分类学研究的一个热点(Hebert et al.,2003a,2003b)。用一段标准的DNA序列来快速鉴定物种，不受个体形态和发育阶段的限制，操作简单且准确率高。线粒体基因细胞色素c氧化酶1基因(COI)可以区分绝大多数的动物物种(Hajibabaei et al.,2006)，而微藻中还没有被广泛接受的DNA条形码序列。RNA转录间隔区序列(internal transcribed spacer,ITS)、1,5
‑
二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基序列(ribulose
‑
1,5
‑
bisphosphate carboxylase/oxygenase largesubunit,rbcL)、编码核糖体RNA的基因18S rDNA和5.8S rDNA作为条形码候选基因，在微藻的分类鉴定中均有应用。Dzhembekova等(2017)利用18S rDNA条形码结合高通量测序技术，对黑海的13个环境样本进行了分析。Moniz等(2009)建议5.8S+ITS2的组合做为硅藻的标准DNA条码比较合适，但也有报道认为ITS+5.8S组合的DNA条形码，并不适用于硅藻的分类(Guo et al.,2014)。rbcL基因也被认为是硅藻的条形码候选基因(Macgillivary和Kaczmarska,2011)。依赖于18S rDNA和rbcL基因作为DNA条形码，Rimet等(2016)建立了硅藻DNA条形码数据库，用于淡水水体环境的监测。ITS序列被认为可以作为甲藻的DNA条形码(Litaker et al.,2007；Wang et al.,2014)，COI基因和18S rDNA序列可作为裸藻纲的DNA条形码(Lukomska
‑
kowalczyk et al.,2016)。
[0004]总的来说，微藻的DNA条形码研究还非常滞后，现有的引物通用性比较差，分辨率较低。目前已开发的DNA条形码，如ITS和18S rDNA等往往只能鉴定到“门”，或者鉴定到“目”，无法鉴定到“科属种”。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，通过比较牟氏角毛藻、纤细角毛藻和
简单角毛藻的叶绿体全基因组序列，利用序列高变区的保守侧翼序列，开发了一对通用引物，在21种微藻中，分别获得了独一无二的叶绿体DNA条形码序列，利用该对引物，可以对21个藻种进行种类区分、鉴别。
[0006]本专利技术的第一个方面是提供一种用于微藻鉴定的引物对，所述引物对的为：cpDNAB2F：5
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TCTTATGGTCACAAGCTTCTCA
‑3’
和cpDNAB2R：5
‘‑
CTGTCATACCATCATGTGCTTC
‑3’
。
[0007]本专利技术的第二个方面是提供一种含有本专利技术第一方面所述引物对的试剂盒。
[0008]本专利技术的第三个方面是提供一种微藻叶绿体DNA条形码库的构建方法，包括以下步骤：(1)分别提取各个微藻的总DNA；(2)利用本专利技术第一个方面所述的引物对、或者本专利技术第二个方面所述的试剂盒对各个微藻DNA进行PCR扩增，测序，比对，得到各个微藻的特征DNA条形码，从而构建微藻叶绿体DNA条形码库。
[0009]其中，所述微藻为表1所示21种微藻：
[0010]表1
[0011][0012][0013][0014]本专利技术的第四个方面是提供本专利技术第三个方面所述方法构建的微藻叶绿体DNA条形码库。
[0015]本专利技术的第五个方面是提供本专利技术第一个方面所述的引物对、或者本专利技术第二个方面所述的试剂盒、或者本专利技术第四个方面所述的微藻叶绿体DNA条形码库在区分微藻中的应用。其中，所述微藻为表1中所示21种微藻。
[0016]本专利技术的第六个方面是提供一种微藻的区分方法，采用本专利技术第一个方面所述的引物对或本专利技术第二个方面所述的试剂盒进行。
[0017]其中，待区分微藻为表1所示21种微藻。
[0018]优选地，所述区分方法包括以下步骤：(1)提取待区分微藻的总DNA；(2)利用本专利技术第一个方面所述的引物对、或者本专利技术第二个方面所述的试剂盒对待区分微藻DNA进行PCR扩增，测序，与本专利技术第四个方面所述的微藻叶绿体DNA条形码库进行比对，从而区分微藻。
[0019]本专利技术提供了一对通用引物，对粗壮半舟藻Seminavis robusta，短缝藻Eunotia sp.，辐节藻Stauroneis sp.，谷皮菱形藻Nitzschia palea，管状藻Fistulifera sp.，黄丝藻Tribonema sp.，卵囊藻Oocystis sp.，牟氏角毛藻Chaetoceros muellerii，内茧藻Entomoneis sp.，皮囊藻Picocystis salinarum，色球藻Chroococcus sp.，双壁藻Diploneis sp.，双眉藻Halamphora americana，双眉藻Halamphora calidilacuna，双眉藻Halamphora coffeaeformis，微囊藻Microcystis sp.，细尖盘杆藻Tryblionella apiculata,纤细角毛藻Chaetoceros gracilis，隐多甲藻Kryptoperidinium foliaceum，舟形藻Navicula sp.和菱形藻Nitzschia supralitorea等21种微藻进行PCR扩增，分别获得了独一无二的叶绿体DNA条形码序列，利用该对引物，可以对21个不同属的藻种进行种类区分、鉴别，并且可以鉴定到属种，其中，粗壮半舟藻Seminavis robusta，谷皮菱形藻Nitzschia palea，牟氏角毛藻Chaetoc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于微藻鉴定的引物对，其特征在于，所述引物对的为：cpDNAB2F：5
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TCTTATGGTCACAAGCTTCTCA
‑3’
和cpDNAB2R：5
‘‑
CTGTCATACCATCATGTGCTTC
‑3’
。2.一种含有权利要求1所述引物对的试剂盒。3.一种微藻叶绿体DNA条形码库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别提取各个微藻的总DNA；(2)利用权利要求1所述的引物对、或者权利要求2所述的试剂盒对各个微藻DNA进行PCR扩增，测序，比对，得到各个微藻的特征DNA条形码，从而构建微藻叶绿体DNA条形码库；其中，所述微藻为下述21种微藻：粗壮半舟藻Seminavis robusta，短缝藻Eunotia sp.，辐节藻Stauroneis sp.，谷皮菱形藻Nitzschia palea，管状藻Fistulifera sp.，黄丝藻Tribonema sp.，卵囊藻Oocystis sp.，牟氏角毛藻Chaetoceros muellerii，内茧藻Entomoneis sp.，皮囊藻Picocystis salinarum，色球藻Chroococcus sp.，双壁藻Diploneis sp.，双眉藻Halamphora americana，双眉藻Halamphora calidilacuna，双眉藻Halamphora coffeaeformis，微囊藻Microcystis sp.，细尖盘杆藻Tryblionella apiculata，纤细角毛藻Chaetoceros gracilis，隐多甲藻Kryptoperidinium foliaceum，舟形藻Navicula sp.和菱形藻Nitzschia supralitorea。4.权利要求3所述的方法构建的微藻叶绿体DNA条形码库。5.如权利要求1所述的引物对、或者权利要求2所述的试剂盒、或者权利要求4所述的微藻叶绿体DNA条形码库在区分微藻中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述微藻为下述21种微藻：粗壮半舟藻Seminavis robusta，短缝藻Eunotia sp.，辐节藻Stauroneis sp.，谷皮菱形藻Nitzschia palea，管状藻Fistulifera sp.，黄丝藻Tri...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亚军，邓晓东，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：