用于提高基因组工程化效率的方法技术

本发明专利技术涉及用于真核细胞中基因组工程化的方法和材料，并且特别涉及经由递送一个或多个RKD2和RKD4基因以及基因组工程化组分来提高基因组工程化(即转化或基因组编辑)效率的方法。方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于提高基因组工程化效率的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年1月29日提交的美国临时申请62/798,010的优先权，其通过引用的方式整体并入本文。


[0003]本文描述了用于真核细胞中基因组工程化的新颖的方法和材料，特别是通过递送编码RKD2和/或RKD4的核酸和基因组工程化组分来提高基因组工程化(即转化或基因组编辑)效率的方法。
[0004]序列表
[0005]本申请案含有以电子方式提交的ASCII格式的序列表，并且通过引用的方式整体并入本文。所述ASCII副本创建于2018年11月25日，名称为KWS0304_SEQLIST_20181123_ST25.txt，大小为73,166字节。

技术介绍

[0006]传统育种提供了驯化的植物和动物，而现代生物技术，特别是基因组工程，正在扩大育种能力，并能够实现仅以传统近缘物种杂交不可能实现的改进。使用生物技术已在作物中引入了如高产量、耐除草剂和抗害虫性等多种特性，使全球农业和粮食安全取得巨大进步。然而，此类生物技术产品中外源DNA的存在可引发生物安全和环境问题。
[0007]通过分离出任何整合的DNA，基因组编辑技术可用于在末端植物中不存在外源DNA的情况下生成靶基因组的位点特异性修饰。此外，通过瞬时表达，基因组编辑可具有瞬时编辑活性以创建位点特异性修饰，而无需在过程的任何时刻进行DNA整合。基因组编辑的植物，特别是衍生自瞬时活性的植物，与传统的基因组修饰的植物有很大不同，并且可能不能作为遗传修饰(GM)的植物调节。因此，基因组编辑技术，特别是经由瞬时编辑的方法，可以为农业提供高精度、安全和强有力的植物育种和发育工具。
[0008]然而，基于瞬时活性的基因组工程面临着更多的挑战。与稳定转化相比，瞬时工程化通常导致较少的修饰的细胞。在没有整合的可选择标记的情况下，识别工程化细胞并在再生植物中实现同源修饰极具挑战性。这些挑战阻碍了瞬时基因编辑作为用于植物改良的育种工具的常规实现。因此，急需提高基因组工程化效率的新颖的方法和材料。

技术实现思路

[0009]一方面提供了一种用于在植物细胞中进行遗传修饰的方法，所述方法包括
[0010](a)向所述植物细胞中引入
[0011](i)包含编码RKD2多肽或RKD4多肽的多核苷酸序列的核酸、包含所述核酸的重组基因，或包含所述核酸的DNA构建体；和
[0012](ii)感兴趣的转基因和/或基因组工程化组分；
[0013](b)任选地，在化学诱导后允许由核酸合成RKD2多肽或RKD4多肽的条件下培养植
物细胞；和
[0014](c)任选地，在允许在RKD2多肽或RKD4多肽存在下通过整合感兴趣的转基因和基因组工程化组分的活性而对所述植物细胞的基因组进行遗传修饰的条件下培养植物细胞；
[0015]其中编码RKD2多肽或RKD4多肽的多核苷酸序列与异源启动子可操作地连接，所述异源启动子是直接化学可诱导的或间接化学可诱导的，优选经由中间转录因子间接化学可诱导的。
[0016]在一些实施方式中，所述方法有效地提高植物再生的效率。在一些实施方式中，所述方法有效地提高植物细胞的再生能力。在一些实施方式中，在步骤(b)中，在直接或间接化学诱导异源启动子后，优选在向植物细胞中添加β
‑
雌二醇或糖皮质激素如地塞米松后，由所述核酸合成RKD2多肽或RKD4多肽。
[0017]在一些实施方式中，异源启动子是用于化学β
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雌二醇化学可诱导性的XVE/OLexA系统。在多种实施方式中，XVE/OLexA系统包含SEQ ID NO：22的核酸序列，或与SEQ ID NO：22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核酸序列。
[0018]在一些实施方式中，异源启动子是可诱导的双向启动子。在多个实施方式中，可诱导的双向启动子与编码期望的多肽的第二核酸序列可操作地连接。在多个实施方式中，所述第二核酸序列包含报告基因和编码报告蛋白的多核苷酸。在一些实施例中，报告子是GUS或tdTomato。
[0019]在多个实施方式中，可诱导的双向启动子是地塞米松可诱导启动子。在一些特定的实施方式中，启动子是pOp1、pOp2、pOp4或pOp6。在一些特定的实施方式中，pOp6包括SEQ ID NO：15的核酸序列，或与SEQ ID NO：15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核酸序列。
[0020]在一些实施方式中，在步骤(a)(i)中，将包含与强组成型启动子可操作连接的编码转录因子的多核苷酸序列的另一核酸引入植物细胞中，其中所述转录因子在与地塞米松结合后激活pOp6。在特定的实施方式中，转录因子是LhGR或LhG4。在一些实施方式中，LhGR具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：17具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；或其中编码LhGR的核酸包括SEQ ID NO：16的编码序列，或与SEQ ID NO：16具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的编码序列。
[0021]在一些实施方式中，所述强组成型启动子是泛素启动子或双35S启动子。在一些特定的实施方式中，双35S启动子包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:21具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列。在一些特定的实施方式中，泛素启动子包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:23具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列。在一些特定的实施方式中，泛素启动子额外包含泛素内含子，所述泛素内含子包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列。
[0022]在一些实施方式中，在允许在RKD2多肽或RKD4多肽存在下通过整合感兴趣的转基因和基因组工程化组分的活性而对所述植物细胞的基因组进行遗传修饰的条件下培养植
物细胞；在一些特定的实施方式中，在不存在有效诱导化学可诱导的启动子的化学剂的情况下，所培养的植物细胞不表达报告基因。在一些实施方式中，植物细胞经培养产生胚性结构。在一些实施方式中，所述胚性结构经培养产生再生植物。
[0023]在多个实施方式中，RKD2多肽或RKD4多肽在植物细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在植物细胞中进行遗传修饰的方法，所述方法包括(a)向所述植物细胞中引入(i)包含编码RKD2多肽或RKD4多肽的多核苷酸序列的核酸、包含所述核酸的重组基因，或包含所述核酸的DNA构建体；和(ii)感兴趣的转基因和/或基因组工程化组分；(b)任选地，在化学诱导后允许由所述核酸合成RKD2多肽或RKD4多肽的条件下培养所述植物细胞；和(c)任选地，在允许在RKD2多肽或RKD4多肽存在下通过整合所述感兴趣的转基因和所述基因组工程化组分的活性而对所述植物细胞的基因组进行遗传修饰的条件下培养所述植物细胞；其中，所述编码RKD2多肽或RKD4多肽的多核苷酸序列与异源启动子可操作地连接，所述异源启动子是直接化学可诱导的或间接化学可诱导的，优选经由中间转录因子间接化学可诱导的。2.权利要求1的方法，其中所述方法有效地提高植物再生的效率。3.权利要求1或2的方法，其中所述方法有效地提高所述植物细胞的再生能力。4.权利要求1至3中任一项的方法，其中在步骤(b)中，在直接或间接化学诱导所述异源启动子后，优选在向所述植物细胞中添加β
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雌二醇或糖皮质激素如地塞米松后，由所述核酸合成RKD2多肽或RKD4多肽。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源启动子是用于化学β
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雌二醇可诱导性的XVE/OLexA系统。6.权利要求5的方法，其中所述XVE/OLexA系统包含SEQ ID NO：22的核酸序列，或与SEQ ID NO:22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核酸序列。7.权利要求1的方法，其中所述异源启动子是可诱导的双向启动子。8.权利要求7的方法，其中所述可诱导的双向启动子与编码期望的多肽的第二核酸序列可操作地连接。9.权利要求8的方法，其中所述第二核酸序列包含报告基因和编码报告蛋白的多核苷酸。10.权利要求9的方法，其中报告子是GUS或tdTomato。11.权利要求7的方法，其中所述可诱导的双向启动子是地塞米松可诱导启动子。12.权利要求11的方法，其中所述启动子是pOp1、pOp2、pOp4或pOp6。13.权利要求12的方法，其中所述pOp6包含SEQ ID NO：15的核酸序列，或与SEQ ID NO:15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核酸序列。14.权利要求12或13的方法，其中在步骤(a)(i)中，将包含与强组成型启动子可操作连接的编码转录因子的多核苷酸序列的另一核酸引入所述植物细胞中，其中所述转录因子在与地塞米松结合后激活pOp6。15.权利要求14的方法，其中所述转录因子是LhGR或LhG4。16.权利要求15的方法，其中所述LhGR具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：17具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；或其中编码LhGR的所述核酸包含SEQ ID NO：16的编码序列，或与SEQ ID NO：16具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的编码序列。17.权利要求14的方法，其中所述强组成型启动子是泛素启动子或双35S启动子。18.权利要求17的方法，其中所述双35S启动子包含SEQ ID NO：21的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：21具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列。19.权利要求17的方法，其中所述泛素启动子包含SEQ ID NO：23的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：23具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列。20.权利要求19的方法，其中所述泛素启动子额外包含泛素内含子，所述泛素内含子包含SEQ ID NO：20的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的核苷酸序列。21.权利要求1至20中任一项的方法，其中在允许在RKD2多肽或RKD4多肽存在下通过整合所述感兴趣的转基因和所述基因组工程化组分的活性而对所述植物细胞的基因组进行遗传修饰的条件下培养所述植物细胞。22.权利要求21的方法，其中在不存在有效诱导化学可诱导的启动子的化学剂的情况下，所培养的植物细胞不表达报告基因。23.权利要求21或22的方法，其中所述植物细胞经培养以产生胚性结构。24.权利要求23的方法，其中所述胚性结构经培养以产生再生植物。25.权利要求1至24中任一项的方法，其中所述RKD2多肽或RKD4多肽在所述植物细胞中瞬时存在、具有瞬时活性和/或瞬时表达，和/或其中编码RKD2多肽的核酸在所述植物细胞中瞬时存在、具有瞬时活性和/或瞬时表达，或编码RKD4多肽的核酸在所述植物细胞中瞬时存在、具有瞬时活性和/或瞬时表达。26.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述RKD2多肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；或所述编码RKD2多肽的核酸编码SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列。27.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述RKD4多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的氨基酸序列；或所述编码RKD4多肽的核酸编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2具有至少75％、76％、77％、78％、79％、8...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：华威大学，
类型：发明
国别省市：