穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC疫苗及DC-CTL方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，细胞治疗技术范畴，具体是穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC疫苗及DC

【技术实现步骤摘要】
穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC疫苗及DC
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CTL方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，细胞治疗技术范畴，具体是穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC疫苗及DC
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CTL方法。

技术介绍

[0002]在前期成功建立体外DC细胞诱导培养技术和预测HLA
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A2限制性肿瘤抗原肽并合成筛选建立肿瘤抗原多肽库的基础上，深入研究不同时间处理促DC成熟、不同浓度抗原肽负载 DC、不同方式负载抗原肽、CD40L转染DC等对DC形态、表型及功能的影响，探讨优化DC促成熟方案、提高DC负载效率、DC抗原提呈效率及DC介导的特异性抗肿瘤应答机制，为探索一种疗效更明显、更安全、免疫反应更具有特异性的DC疫苗及DC
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CTL细胞治疗提供新思路。
[0003]肿瘤疫苗的基本策略是通过构建并使用疫苗来激活肿瘤特异性细胞毒T细(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)，从而有效的诱发特异性抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的。三个标准决定瘤苗杀伤肿瘤的效果：1、体内产生足够多的可高度识别肿瘤抗原的免疫细胞，诱导产生长期记忆细胞；2、这些免疫细胞迁移至肿瘤部位并浸润到肿瘤间质，增殖并活化；3、免疫细胞必须在肿瘤位点被激活，直接溶解或分泌细胞因子引起肿瘤破坏各种针对肿瘤相关抗原(TAA)的材料均可用来制作瘤苗，如肿瘤细胞疫苗、肿瘤核酸疫苗、肿瘤基因工程疫苗和细胞因子瘤苗等。近年来出现的树突状细胞(DC)瘤苗异军突起，成为肿瘤瘤苗研究的新热点。
[0004]一般而言，成熟DC在体外负载肿瘤抗原肽后、非成熟DC前体因接受肿瘤蛋白或裂解物而成熟后，均可作为疫苗使用。要想获得成熟DC，更有效地激DC的活性，培养体系中需加入新的刺激因素，以提高共刺激分子的表达，促进DC成熟。与不成熟DC相比，倾向用成熟DC做肿瘤疫苗，可以避免
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靶抗原特异性T细胞抑制；
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调节T细胞的诱导。
[0005]通过预实验和参考国内外文献报道，我们在前期工作中已建立体外诱导培养成熟DC细胞技术体系，并在预实验中总结DC促成熟方案，拟进一步优化培养方案。
[0006]研究表明体外诱导DC细胞在MLR中可以有效刺激同种异体的T细胞，但在负载效率及摄取抗原效率上有待进一步提高。如何使抗原肽有效进入DC细胞，延长抗原肽在细胞内的降解和延缓其半衰期从而增强其与DC细胞的结合，通过MHCI类分子途径有效地提呈肿瘤特异性抗原，并活化T细胞从而产生对相应肿瘤细胞具有特异性的CTL。重点突破体外诱导成熟DC伴随DC功能的提高，显著提高T细胞的反应性，涉及到DC负载效率和递呈肿瘤抗原多肽效率，与加入肿瘤抗原多肽浓度和抗原肽载体选择等相关。
[0007]随着越来越多针对同一肿瘤抗原的不同肿瘤抗原表位肽的鉴定，进一步研究发现，不同的抗原表位肽刺激引起的免疫反应不同。因而，特异性肿瘤抗原肽是肿瘤免疫治疗的关键，也是当今研究的热点。另外，目前通过各种方法发现的很多同一肿瘤抗原的有数十种不同抗原多肽，不仅有HLA
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I、II类分子递呈的表位，还有HLA
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I类和II类分子同时递呈的表位，可以同时活化CD4+和CD8+T淋巴细胞，有利于增强抗肿瘤免疫应答效果和延长特异性
免疫持续的时间。
[0008]由于多肽疫苗存在HLA表型和抗原肽数目的限制，前期工作重点建立肿瘤抗原多肽库，并且合成的肿瘤抗原多肽递呈的抗原表位肽中，以第一种类型为主，HLA
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I类分子递呈的表位以HLA
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A2分子为主，在我国人群中，HLA
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A2阳性人群占一半以上，特别是 HLA
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A*0201亚型，因此设计合成的肿瘤抗原多肽在本我国产业化现代免疫技术治疗中具有重要应用价值，拟将进一步扩充完善肿瘤抗原多肽库。
[0009]尽管大量的研究指出，活化针对肿瘤抗原的免疫细胞可改善肿瘤免疫反应，例如DCs，然而，另外的研究也同时指出肿瘤微环境决定DC功能，肿瘤抑制性微环境可调控DCs诱导T细胞无能或抑制DCs引发的肿瘤特异性反应。因此，活化直接针对肿瘤的DCs可能不足以产生抗肿瘤效应。从肿瘤微环境以外培育针对TAA的活化DCs有可能改善抗肿瘤免疫反应。使用何种肿瘤抗原、肿瘤抗原表位肽选择及如何将肿瘤抗原肽在体外与DC结合以弥补其功能缺陷，则成了应用DC疫苗进行免疫治疗的关键。寻找一个有效的抗原多肽载体和提高DC递呈效率是解决问题的办法之一，采用抗原表位预测、穿膜肽介导肿瘤抗原多肽和CD40L感染DC方法来达到效果。
[0010]CPPs是一类以非受体依赖方式，非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽，可携带多种物质，如DNA,RNA,多肽，蛋白，小分子化合物等，具有广泛的组织相容性、稳定性、低毒性和低免疫原性、可人工合成相对简便等优点。CPPs携带肿瘤相关抗原进入抗原呈递细胞在疫苗研究中已获得了验证。Wangrongfu等报道显示，利用CPPs可显著提升HLA 限制性多肽的DC细胞穿膜效率，且半衰期显著延长。一系列的研究显示，由此引发的CTL 免疫效应能高表达CD8+T淋巴细胞表达，同时IFN
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γ，GM
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CSF的表达都显著提高。说明该CPPs是有效的。
[0011]如何使DC呈递抗原更特异、效应更高，亦是当今研究的热点。CD40L与肿瘤细胞表面CD40结合，可以直接抑制肿瘤细胞增殖，增加抗肿瘤制剂的敏感性。更重要的是，CD40L 一方面可以诱导DC细胞成熟，延长DC细胞生存期，上调共刺激分子及内源性肿瘤肽表达；另一方面增加一些免疫刺激因子的分泌。从而提高DC的抗原呈递效应，促进T效应细胞的增殖，增强了宿主抗肿瘤免疫的能力。
[0012]CD40L基因转染DC，通过DC以自我或相互活化CD40信号的方式，呈递肿瘤抗原于幼稚CD8+细胞。CD40L转染DC细胞冲击致敏后，其共刺激分子的表达，IL
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12的分泌、对同源T细胞的增殖及同源癌细胞的增殖抑制作用均提高。
[0013]近年来的研究发现,由负载抗原肽后的DC与CTL组成的共培养系统,对表达相关抗原的肿瘤细胞具有更强的杀伤活性,提示这种杀伤作用存在抗原特异性,即提示该体系诱导产生了细胞毒T淋巴细胞(CTL)。
[0014]CTL在控制病毒感染和肿瘤方面起到了重要的作用。在肿瘤特异性CTL的分化、扩增和诱导记忆中，细胞都是必不可少的。T细胞经适宜MHC分子可识别处理多肽抗原，用CTL 细胞鉴定的抗原决定簇可作为疫苗应用，以活化抗原决定簇特异性T细胞。可从肿瘤特异性蛋白中寻找MHC I类和MHC II类限制性T细胞抗原决定簇，用以制作多肽为基础的疫苗。
[0015]穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC疫苗及DC
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CTL技术拟解决的关键问题(1)人工合成肿瘤相关抗原肽MHC的限制性。拟采用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC
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CTL方法，其特征在于：包括具体方法为：S1：DC及CTL体外培养；利用倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜观察DC的表面形态及内部结构变化；用流式细胞术检测DC表面分子CD1a、CD83、CD80、CD86和HLA
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DR的表达情况；用噻唑蓝MTT法检测混合淋巴细胞试验MLR中DC细胞对T细胞的促增殖作用；用LDH法乳酸脱氢酶杀伤试验检测CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤活性；所述DC及CTL体外培养包括体外诱导DC培养标准流程、体外CTL高效扩增培养技术标准操作规程、树突状细胞的鉴定、DC的功能鉴定、肿瘤抗原多肽负载树突状细胞、效应细胞CTL的培养、负载肿瘤抗原多肽DC诱导的CTL对肿瘤细胞的杀伤能力；S2：联合应用抗原表位预测的超基序法、多项式方案及量化基序法预测HLA
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A2限制性肿瘤抗原肽，验证抗原表位预测的可行性；分离、培养及鉴定外周血DC，使DC负载肿瘤抗原肽后，诱导CTL活化、扩增，进而研究对多种肿瘤细胞的杀伤能力，筛选出对多种肿瘤均有较强杀伤作用的肿瘤抗原肽；S3：构建h
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CD40L表达体系；S4：CD40L表达载体的DC细胞转染；S5：表达CD40L的DC细胞通过穿膜肽介导肿瘤抗原肽致敏CTL后体外体内免疫功能的测试；包括细胞因子的分泌、CCK
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8法检测致敏修饰DC
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CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤作用、采用Si
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RNA、致敏修饰DC
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CTL细胞对体内肿瘤细胞的杀伤、芯片筛查肿瘤组织中免疫相关基因和肿瘤标志物的变化、免疫组化检测肿瘤组织中特异性CTL细胞含量。2.根据权利要求1所述的穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC
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CTL方法，其特征在于：所述体外诱导DC培养标准流程：S1：第一天：细胞制备A：抽取抗凝外周血75ml，800g，15min室温离心without breaking；B：自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后
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20℃静置10min；最后4℃，1100g，离心15min，4℃保存备用；C：取上述离心后下部细胞成分，加D
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PBS至50ml，混匀，加到3个装有20ml医疗级淋巴细胞分离液的50ml离心管中，800g，15min室温离心without breaking；D：取细胞层，加入培养基至50ml，600g 10min，弃上清液；E：分离出的PBMC制成细胞悬液50ml，加入到T75培养瓶，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养2h；F：悬浮细胞移至CIK瓶中行CIK培养，贴壁细胞行DC培养；G：向DC培养瓶中，加入5ml血浆，加入适量细胞因子；S2：第二天，向DC培养瓶中，加入剩余血浆，加入适量细胞因子；S3：第四天，向DC培养瓶中，加入适量细胞因子；S4：第五天，向DC培养瓶中，加入适量细胞因子；S5：第六天，向DC培养瓶中，加入本试剂盒适量细胞因子，适量浓度的穿膜肽介导肿瘤抗原多肽；S6：第七天，收集DC。3.根据权利要求1所述的穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC
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CTL方法，其特
征在于：所述体外CTL高效扩增培养技术标准操作规程：S1：包被：20ml D
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PBS加入适量细胞因子，4℃，避光，过夜包被T175培养瓶；或置于37℃培养箱中，至少包被2小时；S2：第一天：细胞制备A：抽取抗凝外周血50ml，800g，15min室温离心without breaking；B：自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后
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20℃静置10min；最后4℃，1100g，离心15min，4℃保存备用；C：取上述离心后下部细胞成分，加D
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PBS至50ml，混匀，加到2个装有20ml医疗级淋巴细胞分离液的50ml离心管中，800g，15min室温离心without breaking；D：取细胞层，加入培养基至50ml，600g 10min，弃上清液；E：分离出的PBMC加入40ml CIK培养液，制成细胞悬液，加入5ml血浆，加入到弃掉包被液的T175培养瓶，同时加入适量细胞因子，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养；S3：第二天补加60mlCTL培养液，加入5ml血浆，加入适量细胞因子；S4：第四天补加50mlCTL培养液，加入剩下所有血浆,加入适量细胞因子；S5：第五天，将培养瓶中细胞完全吹打下来，转移到培养袋，分2个培养袋，建议每个培养袋补至400ml；S6：第七天，视细胞生长状态，建议每个培养袋补加CTL培养液300ml；S7：第十天，视细胞生长状态，建议每个培养袋补加CTL培养液600ml，送检第三方做细菌、真菌、支原体、内毒素检测同时做好自检；S8：第十三天：收集CTL细胞悬液1400ml，1500rpm
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8min离心后弃去上清液，250ml离心管集2管每管生理盐水200ml洗涤1500rpm
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8min1次，再用50ml离心管生理盐水50ml洗涤1200rpm
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8min1次，按照100ml生理盐水+5ml 20％血清白蛋白重悬细胞，封装好后送病房，同时留样封存以备日后检测；补加CTL培养液200ml/袋，送检第三方做细菌、真菌、支原体、内毒素检测同时做好自检；S9：第十五天：收集CTL细胞悬液1600ml，1500rpm
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8min离心后弃去上清液，250ml离心管集2管每管生理盐水200ml洗涤1500rpm
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8min1次，再用50ml离心管生理盐水50ml洗涤1200rpm
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8min1次，按照100ml生理盐水+5ml 20％血清白蛋白重悬细胞，封装好后送病房，同时留样封存以备日后检测。4.根据权利要求1所述的穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC
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CTL方法，其特征在于：所述树突状细胞的鉴定包括DC的形态学观察和DC的表型鉴定，流式细胞术检测DC表面分子HLA
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DR、CD83、CD86的表达，所述DC的形态学观察步骤为：S1：倒置显微镜观察：培养期间每天用倒置显微镜观察细胞形态变化；S2：光学显微镜观察：收取培养8d的m DC，1000rmp离心5min，获取细胞沉淀，经福尔马林固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡浸透和包埋，常规制作石蜡切片，苏木精－伊红(HE)染色后置于光学显微镜下观察并拍照；S3：透射电镜观察：收取培养8d的m DC，1000rmp离心5min，获取细胞沉淀，经2.5％戊二醛和锇酸双重固定、梯度丙酮脱水、环氧树脂浸透和包埋等处理后，常规制作超薄切片，铅铀染色后置于透射电镜下观察并拍照；所述DC的表型鉴定，流式细胞术检测DC表面分子HLA
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DR、CD83、CD86的表达步骤为：S1：分别收取培养4d的im DC和培养8d的m DC，1000rpm离心5min，计数，调整细胞浓度
为1
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106/管；S2：PBS洗涤2次，弃上清，用100μlPBS重新悬浮细胞；S3：加入流式抗体2μg/106细胞，避光室温孵育30min；S4：PBS补足至500μl，充分混匀；S5：流式细胞仪检测。5.根据权利要求1所述的穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC
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CTL方法，其特征在于：所述DC的功能鉴定步骤为：S1：刺激细胞的制备：分别收取培养4d的im DC和培养8d的m DC，调整细胞浓度为1
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105/m；S2：反应细胞的制备：收取与刺激细胞im DC和m DC不同批次脐带血分离培养的淋巴细胞，调整细胞浓度为5
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106/ml；S3：试验在96孔板上进行，共分6组，每组设3个复孔，具体分组如下：空白对照...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐健，李陶，张扬，
申请(专利权)人：浙江圣希澳医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：