基于量子点荧光微球的PCT/IL-6二联检测试剂盒及其制备方法技术

一种基于量子点荧光微球的PCT/IL

【技术实现步骤摘要】
基于量子点荧光微球的PCT/IL
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6二联检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术属于免疫检测领域，尤其是涉及一种基于量子点荧光微球的PCT/IL
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6二联检测试剂盒及其制备方法。

技术介绍

[0002]降钙素原（PCT）是无激素活性的降钙素的前体物质，是由116个氨基酸组成的糖蛋白, 分子量大约为13000。PCT在体内的生成速度很快，其半衰期通常为20～24 h。通常，健康成年人的血清PCT水平低于10 pg/mL。当血清PCT 浓度在0.1~0.5 ng/mL 时，一般认为人体内可能存在细菌感染，浓度达到2.0 ng/mL左右提示发生系统性炎症反应综合征，浓度在范围为1 ng/mL~10 ng/mL之间被认为该患者可能患有脓毒症，而浓度在10 ~100 ng/mL则表明会有脓毒性休克的可能。另外，研究表明PCT在区分细菌感染和非细菌感染方面显示出很高的特异性和敏感性。通常情况下，细菌感染发生3~4 h后，患者体内PCT水平开始上升，12
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48 h达到峰值，并在24 h后达到最高值。与c反应蛋白（CRP）、白细胞计数（WBC）、肿瘤坏死因子（TNF）
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α、白介素
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6（IL
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6）等炎症因子相比，PCT是具有更高的特异性和灵敏度，可用于严重细菌感染的早期诊断、判断病情严重程度、预后、评价抗感染疗效。对全身与局部感染的诊断价值——临床常用的判断脓毒症的重要工具，可以指导抗生素合理使用。
[0003]白介素6（IL
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6）作为败血症早期鉴定最有前途的生物标志物已受到越来越多的关注，其是由184个氨基酸组成的多功能细胞因子，由纤维母细胞、单核巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞以及多种瘤细胞所产生。IL
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6与细菌感染密切相关，可在感染后迅速升高，可调节免疫反应，可用来辅助急性感染的早期诊断并反映感染程度。但是炎性或自身免疫性疾病可能会影响人血清中IL
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6的浓度。据报道，ICU患者体内IL
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6的浓度一般>3000 pg/ml，而健康成年人的IL
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6水平约为6.4 pg/ml，检测敏感性约为85 %，特异性约在62 %左右。病原体感染后，IL
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6的浓度在3 h上升到峰值，并在8 h后下降到基线浓度。另外，IL
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6表现出动力学以监测抗生素治疗的功效。IL
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6在血液中浓度极低（皮克级别），测得准、测得稳的技术门槛极高。因此，目前IL
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6的生产厂家屈指可数。量子点又称半导体纳米晶，呈近似球形，能够接受激发光产生荧光。量子点作为一种新型半导体纳米材料，与普通荧光标记物相比具有独特的优势,如激发光谱宽而连续, 发射光谱窄且可调，荧光强度高，发光时间长，光化学稳定性好及表面易被修饰等。这些优势使量子点成为新一代荧光标记探针的最优选择，目前在生物标记物检测领域已经有了一定程度上的应用和发展。但是量子点的尺寸小，单个量子点荧光强度有限，用于生物标记时暴露在复杂的生理环境中，容易破坏量子点的荧光稳定性。将量子点包载在聚合物微球中形成量子点荧光微球，既能提高单个微球的荧光强度，而且易修饰，便于与生物大分子结合。此外，将量子点装载在微球内部，可提高量子点的抗漂白性、热稳定性和化学环境稳定性等。
[0004]微流控技术指的是使用微管道（尺寸为数十到数百微米）处理或操纵微小流体的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学
工程的新兴交叉学科。微流控芯片是微流控技术实现的主要平台。相比于传统体外诊断产品而言，其可以把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等一系列基本操作单元整合到一个微米尺寸的芯片上，操控极小体积的流体在微小空间中的流动，易于满足生命科学对生物样品进行低剂量、更高效、高灵敏、快速分离分析的需求。目前，越来越多的人尝试将量子点与微流控技术相结合实现生物标志物的定量分析并取得重要进展。
[0005]2017年4月正式发布的《感染相关生物标志物临床意义解读专家共识》中指出，没有任何一个生物标志物是绝对敏感又绝对特异的，不能单凭某个生物标志物的改变来诊断疾病。临床医生仅从患者样本中检测到一种生物标志物，则PCT和IL
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6异常水平的时间差可能导致传染病的误诊。因此，有必要同时检测PCT和IL
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6，这不仅可以区分细菌感染和非细菌感染，而且可以指导抗生素治疗并提高临床治疗效果，而且两个项目联检，可把两个项目同时放在一个试剂卡上进行检测，增加一个收费项目而成本低于两个项目的成本累加可增加医院的利润率，适应了目前医院检验科严控成本的诉求，将使组合有更大的市场潜力。
[0006]PCT的检测方法主要有胶体金法，放射免疫学分析法，透射免疫浊度法，双抗夹心免疫化学发光法。其中放射免疫学分析法虽然灵敏度很高可以达到皮克级别，但是无法区分游离型与结合型PCT和CT基因的相关肽，同时由于含有放射性元素，很容易造成污染，而且耗时长，在临床和实验室中的研究都受到了极大的限制。透射免疫浊度法的原理是利用PCT抗原抗体反应使体系浊度增加，且浊度增加与PCT样品浓度成正比。在临床上应用最广泛的就是胶体金法和ELISA法。胶体金法简单便捷，但是胶体金法只能靠人的主观与比色卡的比较来辨别PCT的大概浓度，属于半定量，且主观性较强，不能进一步确认PCT的具体浓度，影响后期治疗采取的手段及用药量。而ELISA化学发光法，特异性强，灵敏度高但是此方法需要专业人员比较精细的操作，又需较大型仪器的检测，所有过程必须在专业人员的操作下才能完成检测，这对PCT检测的便携性产生了阻碍。快速检测IL
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6的最广泛使用的方法是金侧流测试，其操作简单，响应速度快且成本低廉。该方法的低灵敏度和定性分析限制了其在复杂样品中检测痕量目标的进一步应用。其他一些具有高灵敏度的方法主要有化学发光免疫测定，荧光免疫测定，酶联免疫吸附测定和电化学免疫测定。尽管这些方法已用于测量人血清中PCT和IL
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6的水平，但大多数方法都使用笨重的仪器，并且无法同时检测两种生物标志物，这可能会导致误诊和相当大的治疗延迟。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对现有技术的上述不足，提供一种基于量子点荧光和微流控技术双重特性，将稳定性好、灵敏度高的量子点荧光微球与即时检测的微流控芯片相结合，同时对PCT，IL
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6两种标志物进行快速、准确的联合检测的基于量子点荧光微球的PCT/IL
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6二联检测试剂盒。
[0008]为了解决上述技术问题，本申请提供一种基于量子点荧光微球的PCT/IL
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6二联检测试剂盒，该试剂盒上设置有反应区，第一检测位点、第二检测位点和第三检测位点，所述的反应区设置有抗体标记量子点荧光微本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于量子点荧光微球的PCT/IL
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6二联检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括反应区，第一检测位点、第二检测位点和第三检测位点，所述的反应区内设置有抗体标记量子点荧光微球，所述的第一检测位点上包被有IL
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6捕获抗体，第二检测位点上包被有PCT捕获抗体，第三检测位点上包被有抗鸡IgY捕获抗体。2.根据权利要求1所述的基于量子点荧光微球的PCT/IL
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6二联检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括上壳体、下壳体和位于下壳体上的微流控芯片区；所述微流控芯片区含有样品接收区，样品贮藏区，反应区，时间阀，检测通道和废液区，所述的样品接收区，样品贮藏区，反应区，时间阀，检测通道和废液区沿着介质流动方向顺次连接；所述的反应区设置有抗体标记量子点荧光微球，所述的检测通道上沿着介质流动方向依次设置有第一检测位点、第二检测位点和第三检测位点。3.根据权利要求1所述的基于量子点荧光微球的PCT/IL
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6二联检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤包括:（1）量子点荧光微球标记：首先将量子点荧光微球进行活化处理，然后将PCT抗体或者IL
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6抗体或者鸡IgY抗体加入到活化后的量子点荧光微球溶液中，超声混匀进行标记处理，反应结束后，离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球离心清洗，获得抗体标记量子点荧光微球、然后使用微球储存液进行保存；（2）微流控芯片组装：微流控芯片表面亲水处理后，37
°
C烘箱干燥，于通道相应位置加载捕获抗体；对芯片表面进行封闭，在反应区加入步骤（1）制备的量子点荧光微球溶液，37
°
C烘箱干燥，芯片点样完成后超声键合完成合并；（3）标准品的制备：用标准品稀释液将抗原浓缩液稀释作为标准品抗原母液备用；标准品稀释液为10% BSA溶液、2
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8℃保存；标准品包括标准品A和标准品B，标准品A为PCT抗原母液稀释至100 ng/mL，
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20℃保存，标准品B为IL
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6抗原母液稀释至1000 pg/mL，
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20℃保存；得到基于量子点荧光微球PCT/IL
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6二联检测试剂盒。4.根据权利要求3所述的基于量子点荧光微球的PCT/IL
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6二联检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤（1）中量子点荧光微球活化处理为：将量子点荧光微球置于0.25 mg/mL 的EDC
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NHS中、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，张秀秀，唐静，周义正，
申请(专利权)人：宁波奥丞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：