一种海鞘抗氧化多肽及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种海鞘抗氧化多肽及其制备方法，所述抗氧化多肽的氨基酸序列为Ile

【技术实现步骤摘要】
一种海鞘抗氧化多肽及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种海鞘抗氧化多肽及其制备方法。

技术介绍

[0002]人体每天都会产生大量的自由基，环境因素也会促进人体生成自由基，自由基氧化能力极强，适量的自由基是人体的卫士，可杀灭细菌、病毒，分解毒物，但过量的自由基却会氧化人体正常物质，破坏细胞结构，促使细胞恶变，引起机体细胞和组织损伤，自由基的负面作用与人体的衰老和许多健康疾病有关，如糖尿病、癌症、神经退行性疾病等。
[0003]人体内存在一些天然的抗氧化剂可以消除自由基对人体的危害，例如维生素C和维生素E，一些合成抗氧化剂也能起到清除自由基的作用。但研究表明，人工合成抗氧化剂对人体具有一定的毒副作用。例如2
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叔丁基对苯二酚(TBHQ)导致DNA损伤对动物有致突变的可能，2,6
‑
二叔丁基对甲基苯酚(BHT)有致癌作用，没食子酸丙酯(PG)对肾脏有损害同等。为缓解众人对人工合成抗氧化剂安全性的担忧，开发天然抗氧化剂越来越受到食品工业和科学界的关注。蛋白质经过酶水解后得到生物活性多肽，多肽中的氨基酸残基赋予蛋白质本身不具备的某些生物学活性，例如抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、免疫调节等。抗氧化肽是一类具有清除基体自由基、抑制延缓脂质过氧化以及与金属离子螯合等能力的生物活性肽。
[0004]海洋作为地球最庞大的生态系统，蕴藏着极其丰富的生物资源，海洋生物为了适应纷繁复杂的海洋环境，产生了大量异于陆地生物的功能性物质。目前已从海洋生物中分离出多种具有良好抗氧化活性的多肽。海鞘俗称海凤梨，种类约有1500种，常附着在舰船底部、海底礁石上。真海鞘是其中广泛食用养殖的经济海产品。真海鞘中蛋白质含量占34％，是除水分外含量最多的物质，但对真海鞘中抗氧化活性肽的研究较少。如何从可食用的真海鞘中获取具有特定氨基酸序列的高效抗氧化多肽就成为迫切的研究方向。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的旨在提供一种从真海鞘内囊中制备抗氧化多肽的方法，用天然抗氧化剂代替合成抗氧化剂，为开发基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定基础。
[0006]本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术提供了一种海鞘抗氧化多肽，其氨基酸序列为Ile
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Ser
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Trp。
[0008]在本专利技术的另一方面，提供了所述海鞘抗氧化多肽的制备方法，以海鞘内囊肉块为原料，采用中性蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽。
[0009]本专利技术采用复合蛋白酶，作为一种内切酶，作用于蛋白质分子内部肽键，不会切割末端产生游离氨基酸，保证产生的都是多肽链。同时酶法制备活性肽中最明显的副作用是在酶切过程中，会出现漏切位点和非专一性酶切位点，最终无法保证绝对把蛋白质酶切为
常规的肽段，造成许多不必要的产物生成。不同种类酶的切割位点不同，复合蛋白酶中含有多种单酶，含有多种酶切位点，防止漏切位点。其中的风味蛋白酶对水解的苦味和风味起着优化作用，广泛应用于动物蛋白的水解。
[0010]所述海鞘抗氧化多肽的制备方法具体包括以下步骤：
[0011]1)取真海鞘内囊，去除内脏和筋膜，煮沸灭酶，制得海鞘内囊肉块；
[0012]2)肉块破碎后置于石油醚中除脂、加入乙醇除色素，制得海鞘粗蛋白；
[0013]3)采用复合蛋白酶酶解海鞘内囊蛋白，酶解后沸水浴灭酶，冷却至室温，离心取上清液待用；
[0014]4)用卷式聚砜超滤膜进行超滤，得到不同分子量的多肽组分；
[0015]5)蒸发浓缩后的超滤液在真空下进行冷冻干燥，得到多肽组分；
[0016]6)采用DPPH和ABTS自由基活性测定，选取活性最高的组分；
[0017]7)通过柱层析进行分离纯化，冷冻干燥后测定各吸收峰对应洗脱液的抗氧化活性，收集得到的抗氧化活性最高的组分；
[0018]8)使用C18色谱柱和DPPH消去法确定抗氧化活性峰，收集抗氧化多肽。
[0019]进一步的，步骤1)中采用超纯水100℃煮15min灭酶。
[0020]进一步的，步骤3)中酶解条件为：水浴加热保持温度为50℃，酶与底物的比例为1:4。
[0021]进一步的，步骤4)中卷式聚砜超滤膜的截留量包括30kDa、5kDa、1kDa和500Da；得到的多肽组分包括分子量为30kDa
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5kDa、5kDa
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1kDa、1kDa
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500Da以及<500Da的多肽。
[0022]进一步的，步骤5)中蒸发浓缩条件为：55℃，压力为0.1Mpa。
[0023]进一步的，步骤7)中固定相为葡聚糖凝胶G
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25，流动相为超纯水，其中凝胶柱体积为500ml，进样量为24ml，进样浓度为20mg/ml，流速为1.5ml/min，检测波长280nm。
[0024]本专利技术的有益效果为：
[0025]本专利技术从可食用的真海鞘内囊中制备出一条氨基酸序列为Ile
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Ser
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Trp的高效抗氧化多肽，提供了一种新的天然抗氧化剂，可以替代合成抗氧化剂，打消了人们对人工合成抗氧化剂安全问题的担忧，同时满足了抗氧化剂的市场需求。同时开发出一种针对真海鞘内囊抗氧化肽的制备及分离纯化方法，提高了真海鞘加工的附加值，拓宽了海洋天然产物的研究。
附图说明
[0026]图1为本专利技术实施例1超滤后各个组分的ABTS自由基清除活性；
[0027]图2为本专利技术实施例1超滤后E组分(<500Da)的DPPH自由基清除活性；
[0028]图3为本专利技术实施例1Sephadex G
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25分离纯化图谱；
[0029]图4为本专利技术实施例1Sephadex G
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25分离纯化后各个组分的自由基清除活性；
[0030]图5为本专利技术实施例1DPPH消去法确定抗氧化活性峰；
[0031]图6为合成多肽Ile
‑
Ser
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Trp的自由基清除能力。
具体实施方式
[0032]下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显
然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0033]实施例1
[0034]海鞘抗氧化多肽的制备，包括以下步骤：
[0035]1)真海鞘处理：真海鞘解冻后去除外壳取内囊，去除内囊中的内脏、筋膜，加超纯水100℃煮15min灭酶，制得海鞘内囊肉块待用。
[0036]2)除杂：肉块破碎后置于石油醚中除脂、加入乙醇除色素，制得海鞘粗蛋白，待用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海鞘抗氧化多肽，其特征在于，其氨基酸序列为Ile
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Ser
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Trp。2.权利要求1所述海鞘抗氧化多肽的制备方法，其特征在于，以海鞘内囊肉块为原料，采用复合蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的复合蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取真海鞘内囊，去除内脏和筋膜，煮沸灭酶，制得海鞘内囊肉块；2)肉块破碎后置于石油醚中除脂、加入乙醇除色素，制得海鞘粗蛋白；3)采用复合蛋白酶酶解海鞘内囊蛋白，酶解后沸水浴灭酶，冷却至室温，离心取上清液待用；4)用卷式聚砜超滤膜进行超滤，得到不同分子量的多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：卜迁，麻蕊，侯青，高鸿，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：