一种C端带有表位标签M的表达载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种C端带有表位标签M的表达载体及其构建方法与应用，首先构建C端带有表位标签M的真核表达载体；将所述C端融合有所述表位标签的真核表达载体与编码目标蛋白的核苷酸序列进行重组，获得重组表达载体；将所述重组表达载体在所述真核生物中进行表达；以M作为标签进行蛋白免疫印迹实验、或/和免疫沉淀实验或/和、免疫荧光实验或/和流式细胞术实验；本发明专利技术构建的表达载体pQFC

【技术实现步骤摘要】
一种C端带有表位标签M的表达载体及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种C端带有表位标签M的表达载体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]1984年，1984年Munro和Pelham发表的文章第一次将抗原表位标签通过重组DNA的方法应用于检测果蝇hsp70蛋白的突变体。为了单独观察突变后的蛋白质在细胞中的活动，设计融合一个高敏感性和独特性的表位标签于蛋白末端，用该表位标签所对应的抗体进行检测。由次以后，表位标记技术可以用来检测没有特异抗体的重组蛋白，同时方便科研人员检测比较转基因的产物和内源基因的产物的异同。相较于传统内源性蛋白耗时耗力以及不可预测性，选用为标记蛋白的标签抗体更容易获得，灵敏度更高，可以通过各种生化和细胞生物学技术检测，包括流式细胞术、蛋白免疫印迹和免疫荧光染色，抗体针对每个标记具有特异性。标记系统也广泛应用于亲和纯化和免疫沉淀。
[0003]能够用作标签的氨基酸序列有一定的要求。一，表位标签蛋白大小一般为6
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30氨基酸，不会影响融合蛋白的生物活性。二，很重要的是具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种C端带有表位标签M的表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括：采用XhoI和NotI酶切空载pQFC
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FLAG3‑
SKP1，获得带有XhoI和NotI酶切端口的pQFC
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FLAG3；将含GFP序列载体为模板采用如SEQ ID NO：3
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SEQ ID NO：4所示的引物对进行PCR，获得GFP基因片段；后将所述GFP基因片段采用XhoI和NotI双酶切后与所述带有XhoI和NotI酶切端口的pQFC
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FLAG3酶连，获得pQFC
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FLAG3‑
GFP；采用NotI和BamHI酶切所述pQFC
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FLAG3‑
GFP，获得带有NotI和BamHI酶切端口的pQFC
‑
GFP；将含表位标签M序列载体为模板采用如SEQ ID NO：5
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SEQ ID NO：6所示的引物对进行第一退火，获得带有NotI和BamHI的M1片段；将所述M1片段与所述带有NotI和BamHI酶切端口的pQFC
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GFP酶连，获得pQFC
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M
‑
GFP；或者将含表位标签M序列载体为模板依次采用如SEQ ID NO：7
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SEQ ID NO：8所示的引物对和如SEQ ID NO：9
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SEQ ID NO：10所示的引物对进行第二退火，获得带有NotI和BamHI的M3片段；将所述M3基因片段与所述带有NotI和BamHI酶切端口的pQFC
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GFP酶连，获得pQFC
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M3‑
GFP；用XhoI和EcoRI酶切所述pQFC
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M
‑
GFP或者所述pQFC
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M3‑
GFP，获得具有XhoI和EcoRI酶切端口的线性载体pQFC
‑
M或者pQFC
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M3；将如SEQ ID NO：11
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SEQ ID NO：14所示的退火引物退火后连接到所述具有XhoI和EcoRI酶切端口的线性载体pQFC
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M，得到具有XhoI、AgeI、PacI、BamHI和NotI五个酶切位点的空载pQFC
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M；或者将如SEQ ID NO：7
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SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：15所示的退火引物退火后连接到所述具有XhoI和EcoRI酶切端口的线性载体pQFC
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M3，得到具有XhoI、AgeI、PacI、BamHI和NotI五个酶切位点的空载pQFC
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【专利技术属性】
技术研发人员：付碧石，赵琳，赵雯，粟硕，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：