本发明专利技术公开了一种大黄素甲醚高产菌株，同时提供了上述菌株的获得方式以及大黄素甲醚产量分析的方法，本发明专利技术所提供的大黄素甲醚高产菌株为Aspergillus chevalieriBYST1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC2021285，保藏日期为2021年3月26日。本发明专利技术提供了该菌株的获得方式，以及大黄素甲醚的产量分析，主要包括以下几个步骤：(1)菌株的分离纯化；(2)发酵并分离鉴定主要成分大黄素甲醚；(3)液相定量大黄素甲醚的产量；(4)利用九种不同培养基摇瓶发酵，评估大黄素甲醚的产量差异。该菌株在液体PDB培养基中发酵，大黄素甲醚的产量为28mg/L,为目前报道最高。醚的产量为28mg/L,为目前报道最高。醚的产量为28mg/L,为目前报道最高。
【技术实现步骤摘要】
一株大黄素甲醚高产菌株Aspergillus chevalieri BYST1
[0001]本专利技术属于生物
，提供了一株大黄素甲醚高产菌株。
技术介绍
[0002]大黄素甲醚，别名朱砂莲乙素；非斯酮；1,8
‑
二羟基
‑3‑
甲氧基
‑6‑
甲基蒽醌，为金黄色针状结晶。大黄素甲醚不仅可抑制真菌的萌发生长，还可诱导作物产生抗逆保卫反应；对多数作物白粉病具有极好的防治作用，同时对霜霉病、灰霉病、炭疽病等也有较好的防效；大黄素甲醚对人畜毒性极低，对环境友好，特别适合于绿色和有机蔬菜生产的生物制剂。
[0003]目前，大黄素甲醚已经被我国自主开发为新型植物源杀菌剂，在病害防治方面作用巨大，市场经济效益好，但此种方法，与绿色经济理念背离，对植物需求量大，残渣多，且产量普遍较低，微生物发酵法主要原料葡萄糖属于可再生资源，成本较低，产品收率更高。
技术实现思路
[0004]本专利技术针对以上技术不足，提供了一株大黄素甲醚高产菌株，命名为Aspergilluschevalieri BYST1,保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年3月26日；保藏号：CCTCC M 2021285。本菌株为黑翅土白蚁共生菌，通过摇瓶发酵生产大黄素甲醚的产量为28mg/L，对日后投入农药生产具有重要意义。
[0005]昆虫共生菌是一类特境微生物，是许多新的活性天然产物的来源。本专利技术是对一株分离自黑翅土白蚁的Aspergillus chevalieri BYST1菌株制备大黄素甲醚的方法，步骤如下：
[0006](1)BYST1菌株发酵液的制备：菌株BYST1接种于ME(生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨1g，1000mL水)液体培养基中，于28℃，180r/min条件下,摇床培养3d后所得种子液再接种至其他培养基中大量发酵7d后获得发酵液。
[0007](2)代谢物的分离纯化：减压浓缩Aspergillus chevalieri BYST1菌株发酵液经乙酸乙酯萃取后的有机层获得粗浸膏。并用二氯甲烷，甲醇体积比为(100:0、100:1、100:2、100:4、 100:8)为流动相梯度洗脱，合并相同组分分析结果，得到四个组分Fr1
‑
Fr4。将Fr1重新装硅胶柱，再以石油醚:乙酸乙酯体系梯度，石油醚：乙酸乙酯为5:1(v/v)洗脱得到化合物 A1(320mg)。
[0008](3)代谢物的鉴定：采用质谱(ESI
‑
MS)和核磁共振方法(1H
‑
NMR、
13
C
‑
NMR)对化合物A1进行结构鉴定,确定化合物为大黄素甲醚，其结构如下：
[0009][0010]进一步的对发酵培养基进行筛选后，大黄素甲醚的产量可以达到28mg/L,为目前
报道最高。
[0011]综上所述本专利技术获得一株大黄素甲醚高产菌株Aspergillus chevalieri BYST1，利用摇瓶实验，大黄素甲醚的产量达28mg/L，为目前报道最高。鉴于大黄素甲醚具有优异的防治白粉病等植物致病菌的效果，本技术专利技术具有良好的应用价值，特别是具备开发成高产大黄素甲醚微生物底盘细胞的潜力。
附图说明：
[0012]图1为本专利技术实施例提供的菌株Aspergillus chevalieri BYST1发酵主要产物大黄素甲醚的化学结构式。
[0013]图2为本专利技术实施例提供的菌株Aspergillus chevalieri BYST1的菌落形态。
[0014]图3为本专利技术实例提供的菌株在液体PDB培养基中发酵产物的HPLC检测图。图4为本专利技术实例提供的利用HPLC建立的大黄素甲醚标准曲线。图5为本专利技术实例提供的菌株在不同液体培养基中生产大黄素甲醚产量的柱形图。
具体实施方式
[0015]下面结合具体实施案例对本专利技术做进一步的解释。
[0016]实施例1、黑翅土白蚁共生真BYST1(Aspergillus chevalieri BYST1)的分离、纯化与鉴定：
[0017]供试黑翅土白蚁采自浙江兰溪，从新挖掘的白蚁巢中，用无菌镊子取出兵蚁(20头) 至于灭菌离心管中，加入1mL pH 7.4的无菌PBS缓冲液，震荡得到漂洗液；再用无菌水将其稀释成10
‑1、10
‑2、10
‑3三个浓度梯度。分别取各浓度梯度稀释液0.2mL涂布于PDA固体培养基上，于28℃恒温箱中倒置培养。待菌落长出后，从菌落边缘挑取少量孢子，转接到新的PDA培养基上，如此反复转接得到单菌落，并将该单菌落BYST1保存至高氏试管斜面备用。
[0018]用真菌基因组DNA试剂盒提取上述样品的基因组DNA，采用真菌通用引物ITS1序列进行PCR扩增。并将PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。所得序列经 NCBI数据nucleotide blast工具比对分析鉴定该菌株为Aspergillus chevalieri。
[0019]上述PDA培养基配方为：将200g马铃薯去皮切碎，煮烂后取得土豆汁，加入20g葡萄糖，加入琼脂15～20g，加水至1000mL，置于121℃，灭菌20min。将上述真菌Aspergilluschevalieri转接保存至PDA斜面试管备用。对上述真菌BYST1进行了菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年3 月26日；保藏号：CCTCC M 2021285。
[0020]实施例2、黑翅土白蚁共生真菌Aspergillus chevalieri BYST1的液体发酵及活化：将按照实施例1所述方法制备得到的菌株Aspergillus chevalieri BYST1培养四天的后接种于麦芽液体培养基(生麦芽,20.0g/L；蔗糖,20.0g/L；蛋白胨,1.0g/L；水，1000mL)中，摇床恒温恒速(28℃，180rpm)培养三天后制得种子液并接种到9种不同培养基中，28℃，180r/min，摇床培养7d，收集得发酵液经三次乙酸乙酯等体积萃取后减压浓缩其中有机层得到粗浸膏 10g。
[0021]实施例3、黑翅土白蚁共生真菌Aspergillus chevalieri BYST1代谢产物的分离
纯化：将按照实施例2所述方法制备而得的粗浸膏干法上样，湿法装柱，经二氯甲烷/甲醇进行体积比依次为(100:0、100:1、100:2、100:4、100:8)的梯度洗脱，得四个不同组分Fr1
‑
Fr4，将Fr1重新装硅胶柱，依次经石油醚：乙酸乙酯体系梯度洗脱，石油醚：乙酸乙酯5:1(v/v) 洗脱得到一黄色粉末，命名为A1。最后结合多种波谱技术对该化合物进行结构鉴定，最终确定A1为大黄素甲醚，其波谱数据如下：
[0022]化合物A1(大黄素甲醚)：橙黄色针状晶本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.共生真菌Aspergillus chevalieri BYST1，该菌种于2021年3月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC M 2021285。2.根据权利要求1所述的一株大黄素甲醚高产菌株的制备方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：1)、将培养四天的菌株Aspergillus chevalieri BYST1接种于麦芽液体培养基中，摇床恒温恒速(28℃，180rpm)，培养三天，得种子液；2)、将种子液接种到PDB及ME液体培养基中，28℃，180r/min，摇床培养7d，得发酵液；3)、将步骤2)所得发酵液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥，得粗浸膏。4)、将步骤3)所得粗浸膏经干法上样，湿法装柱，采用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，二者的体积比依次为(100:0、100:1、100:2、100:4、100:8)，得四个不同组分Fr1
‑
Fr4。5)、将所得的第3种洗脱部分Fr1重新装硅胶柱，依次经石油醚：乙酸乙酯体系梯度洗脱，石油醚：乙酸乙酯5:1(v/v)洗脱得到一黄褐色粉末，确认为化合物A1。3.依据权限要求2所述方法制备而得的化合物A1，采用质谱(ESI
‑
MS)和核磁共振方法(1H
【专利技术属性】
技术研发人员：张应烙，张蜀香，吴菲，尹彩萍，李喆，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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