本发明专利技术涉及水产养殖技术领域，具体是一种快速定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量的试剂盒及其应用，所述试剂盒内包括定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量的试纸，其制备方法为：首先提取卵黄磷蛋白、蛋白纯化，然后通过免疫小鼠制备多克隆抗体、单克隆抗体，以及后续对多克隆抗体效价测定、抗体配对筛选，最后制备金标抗体复合物和胶体金试纸。其优点表现在：本试剂盒可用于蟹类卵黄磷蛋白含量的定性检测，避免了传统的复杂方法，且检测时间短、准确率高，在一定程度上减少了财力、时间和工作量，并在提高工作效率的基础上，极大的提到了检测敏感度，最低检出限约为1ug/ml。检出限约为1ug/ml。检出限约为1ug/ml。
【技术实现步骤摘要】
一种快速定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量的试剂盒及其应用
[0001]本专利技术涉及水产养殖
，具体地说，是一种快速定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量的试剂盒及其应用。
技术介绍
[0002]经济蟹类是我国水产品的重要组成部分，经中国渔业年鉴统计，至2014年，我国各类经济蟹类市场消费量达60万吨，其中主要的经济蟹类包括中华绒螯蟹，三疣梭子蟹，拟穴青蟹，远海梭子蟹等，为适应市场的巨大需求，我国自上世纪八十年代起逐步开始各种经济蟹类的人工养殖，随着经济蟹类养殖规模的不断扩大，制约养殖发展的主要问题是优质苗种稀缺。由于蟹类和鱼类不同，在孵化后要经过数次蜕壳，变态才能变为真正意义上的“蟹苗”，这一复杂特性导致目前蟹类育苗水平普遍偏低，亲本性腺发育不良、抱卵量低、胚胎发育死亡率高、幼体育成率低等都造成了优质苗种的供应不足。此外，低效的育苗技术导致每年需要从野生资源中捕获大量的亲本或者天然苗种才能满足生产需求，这必然给经济蟹类的自然资源保护带来巨大的压力，因此提高蟹类人工育苗的成功率，是经济蟹类养殖产业可持续发展的基础。
[0003]甲壳类在胚胎发育过程中均形成卵黄囊结构，卵黄囊中的卵黄物质是整个胚胎发育过程中唯一的营养来源，在孵化后，卵黄囊中依然存有部分卵黄物质，为初孵幼体提供能量，待卵黄物质消耗完毕，卵黄囊特化为肝胰腺，幼体才开始从外界摄食获取营养。由于甲壳动物这种孵化后依然靠自身卵黄物质供能一段时间的特性，给育苗工作带来很大的难题，蚤状幼体孵化后恰到时机的投饵，是保证育苗成功的重要因素之一。过早的投饵，幼体并不摄食，饵料在水中影响水质，过晚投饵，幼体已经处于饥饿状态，会对接下来的变态发育造成不可逆的伤害，最佳的投饵时机是幼体体内卵黄物质刚好消耗完毕，开始开口摄食。在目前的蟹类育苗生产中，在何时开始投饵一直靠经验来判断，不同甲壳动物的初孵幼体所携带的卵黄物质并不相同，因此，不同的甲壳动物幼体的最适宜投饵时机均不相同。即使是同一物种，由于亲本营养情况不同，水温水质等环境因素的差异，均会影响最适投饵时机。由此可见，目前靠人为经验判断最适投饵时机不仅准确率低，而且无法量化，阻碍了育苗技术的标准化推广，因此目前亟需一种能快速有效确定幼体体内卵黄物质含量的检测手段来突破此瓶颈。
[0004]中国专利申请：CN201210557080.1公开了一种定性检测鲤科鱼类卵黄脂磷蛋白的试剂盒及其应用，其试剂盒含有金鱼卵黄脂磷蛋白纯品与鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体。其制备方法为首先纯化出金鱼卵黄脂磷蛋白，通过免疫小鼠制备鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗血清，进一步纯化获得鼠抗金鱼卵黄脂磷蛋白多克隆抗体，该试剂盒可以用于鲤科鱼类卵巢和仔鱼体内卵黄脂磷蛋白的鉴定和定性分析，避免了传统的糖、磷、脂染色、氨基酸组成分析等复杂方法，在一定程度上减少了财力、时间和工作量，并在提高工作效率的基础上，极大得提高了检测敏感度，最低检出限约为100ng/ml。但该专利公开的是鱼类卵黄磷脂蛋白的定性检测。
[0005]中国专利申请：CN201110292690.9公开了一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，涉及一种鲟科鱼类卵子的筛选方法。要解决现有的鱼类卵子质量的检测方法中缺少综合评价，导致评价方法存在偏差的问题。方法：一、从鲟科鱼类体内取出卵子；二、制备卵提取液；三、血清的制备；四、体液的制备；五、测定卵母细胞的极化指数；六、测定血清卵黄蛋白原浓度；七、测定Fe离子的含量、卵Zn离子的含量、卵VE的含量和卵谷草转氨酶的含量；八、测定ACP的含量和AKP的含量；九、测定的各项指标同时满足目标值，即表明同一卵巢内的其他卵子已达到成熟，即完成鲟科鱼类卵子的筛选。该专利技术方法使鲟鱼的受精率达85％以上，孵化率达到95％，鱼苗的成活率达到90％。用于鲟科鱼类的繁殖。但该专利公开的仍旧是鱼类卵黄磷脂蛋白的定性检测。
[0006]因此本专利技术针对现有技术的不足，创造性的首次提出了一种针对蟹类卵黄磷蛋白含量的定性检测试剂盒，关于本专利技术一种快速定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量的试剂盒及其应用目前还未见报道。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种快速定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量的试剂盒及其应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种快速定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量的试剂盒，所述试剂盒包括一个盒体，该盒体内装有：纯化卵黄磷蛋白试剂、无卵黄磷蛋白纯品、离心管、定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量试纸。
[0010]优选地，所述的纯化卵黄磷蛋白试剂包括：丙烯酰胺单体、浓缩胶缓冲液、分离胶缓冲液、电极缓冲液。
[0011]优选地，所述的定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量试纸包括：底板、样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，所述底板上依次覆盖样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，所述金胶垫上含有胶体金与抗卵黄磷蛋白单抗结合形成的金标抗卵黄磷蛋白抗体复合物，所述硝酸纤维膜层上设有抗卵黄磷蛋白多克隆抗体溶液印制的测试线(T线)及羊抗鼠IgG抗体溶液印制的质控线(C线)。
[0012]优选地，所述的金标抗卵黄磷蛋白抗体复合物的制备方法包括步骤：取胶体金溶液，加入0.2mol/L K2CO3溶液，K2CO3加入量为7μL/mL，然后加入透析好的抗卵黄磷蛋白单抗，单抗的加入量为10μg/mL，过夜稳定后加入终浓度为1％的BSA混匀。
[0013]优选地，所述的金胶垫由玻璃纤维和固定其上的金标抗体组成，所述的样品垫为吸水性玻璃纤维。
[0014]优选地，所述试剂盒内还包括使用说明书，所述说明书记载了：如果定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量试纸上出现两条线，则代表蚤状幼体中含有未消化完的卵黄磷蛋白。
[0015]优选地，所述的试剂盒对于中华绒蟹蟹卵黄磷蛋白的检测限为1ug/ml。
[0016]优选地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
[0017](1)卵黄磷蛋白提取；
[0018](2)卵黄磷蛋白纯化；
[0019](3)将定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量试纸插入离心管中，读取结果。
[0020]第二方面，本专利技术提供了如上所述的试剂盒在快速定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量中的应用。
[0021]本专利技术优点在于：
[0022]目前对于甲壳类蟹类的投饵时间一般都是根据经验人为控制，但靠人为经验判断最适投饵时机不仅准确率低，而且无法量化，阻碍了育苗技术的标准化推广，本专利技术针对该缺陷，创造性的首次提出了一种快速定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量的试剂盒，实验结果表明使用该试剂盒对蟹类卵黄磷蛋白含量进行检测时，不但具有检测时间短、工作量少，还同时具有检测准确率高、检测下限低的优点，从而促进了育苗技术的标准化推广，进而提高了蟹类人工育苗的成功率，实用性强，有很好的应用前景。
附图说明
[0023]附图1是兔多抗wb检测结果。
[0024]附图2是兔多抗elisa检测结果。
[0025]附图3是本专利技术的金标试纸实际使用检测结果。
[002本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种快速定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一个盒体，该盒体内装有：纯化卵黄磷蛋白试剂、无卵黄磷蛋白纯品、离心管、定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量试纸。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的纯化卵黄磷蛋白试剂包括：丙烯酰胺单体、浓缩胶缓冲液、分离胶缓冲液、电极缓冲液。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的定性检测蟹类卵黄磷蛋白含量试纸包括：底板、样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，所述底板上依次覆盖样品垫、金胶垫、硝酸纤维膜层和吸水纸层，所述金胶垫上含有胶体金与抗卵黄磷蛋白单抗结合形成的金标抗卵黄磷蛋白抗体复合物，所述硝酸纤维膜层上设有抗卵黄磷蛋白多克隆抗体溶液印制的测试线(T线)及羊抗鼠IgG抗体溶液印制的质控线(C线)。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的金标抗卵黄磷蛋白抗体复合物的制备方法包括步骤：取胶体金溶液，加入0.2mol/L K2CO3溶液，K2CO3加入量为7μL/mL，然后加入透...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘智俊，李建忠，李住，陆锦天，祖露，刘金金，
申请(专利权)人：上海市水产研究所上海市水产技术推广站，
类型：发明
国别省市：
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