一种特异性白念珠真菌荧光染色液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种特异性白念珠真菌荧光染色液及其制备方法和应用。每1L特异性白念珠真菌荧光染色液中含有：粘附肽原液0.05～0.15g、链霉亲和素

【技术实现步骤摘要】
一种特异性白念珠真菌荧光染色液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种特异性白念珠真菌荧光染色液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着广谱抗生素、抗肿瘤化疗、免疫抑制剂等药物的广泛应用，条件致病性真菌感染，特别是深部真菌感染的发病率呈明显上升趋势。白念珠菌是最常见的条件致病性共生真菌之一，是健康人体微生物群的一部分，存在于宿主的口腔、表皮、胃肠道及阴道等处，在免疫功能低下的患者中可引起严重和频繁的粘膜念珠菌感染，如口腔和阴道的念珠菌病(VVC)或系统性念珠菌血症。感染后病情发展快，在国内综合医院白念珠菌感染病死率达37.7％。目前治疗真菌感染的有效手段仍是抗生素类药物治疗，而与其他微生物相比，念珠真菌的结构更加复杂，拥有细胞壁结构，而且感染无特异性临床表现，极易导致漏诊误诊，影响疾病的治疗。因此对白念珠菌感染的早期发现和准确鉴定对于临床给药治疗以及流行病学研究意义重大。
[0003]传统的真菌实验室诊断方法主要包括真菌分离培养法、组织病理鉴定、PCR法等，病理鉴定的特异度和灵敏度均较低，同时检测周期长，不能快速将白念珠菌与其他念珠菌区分，存在诊断给药延迟的可能；真菌分离培养法特异度高，能分辨菌属，但取材要求高，培养要求高，检测周期长，有假阴性；PCR法耗时长，需要较高的实验室条件，无法推广普及。临床常用的真菌快速检测方法有KOH湿片法、真菌镜检、革兰氏染色法、荧光检测法等。其中KOH湿片法操作简单，常有各种杂质导致视野背景较杂乱，非常依赖检测人员的经验与技术水平但灵敏度、特异性及准确率低；革兰氏染色法操作较为复杂，结果不准确，无法确认是否为真菌感染，而其他创伤性诊断手段常受到患者病情和身体状况的限制。
[0004]荧光检测法是一种已有较多应用的快速检测真菌方法。市场上流通的荧光检测真菌试剂盒，主要成分为荧光试剂、促溶剂和背景染料。目前常用的荧光试剂为Calfluor White(CFW),能与真菌细胞壁内的几丁质成分结合，在紫外的激发下发生蓝色荧光。但CFW特异性结合能力较差，可以与大部分真菌结合，需要另外人工判断菌属，同时淬灭时间短，能使背景组织发出明亮的荧光，影响真菌与背景的判断。所以CFW一般需要联合背景染料以去除背景干扰，利用促溶剂分解待测样品角质层。后来市场上出现利用重组几丁质酶标联的荧光素试剂盒检测真菌，此类方法提高了特异性和稳定性，但是生物酶较容易失活不易保存，而且几丁质酶检测法是广谱真菌检测方法，不能特异性识别白念珠菌。因此，有必要提供一种高特异性、高灵敏度的特异性白念珠真菌荧光染色液，以解决现有技术中的不足。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种特异性白念珠真菌荧光染色液及其制备方法和应用，以解决上述技术问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种特异性白念珠真菌荧光染色液，每1L特异性白念珠真菌荧光染色液中含有：粘附肽原液0.05～0.15g、链霉亲和素
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荧光素复合物0.05～1g、渗透剂5～25g、稳定剂30～225g、抗猝灭剂7～35g。
[0008]优选的，所述粘附肽原液中粘附肽的序列为APKLRIPSLK
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biotin，分子结构式如I所示：
[0009]优选的，所述粘附肽原液是由粘附肽粉末和含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液配制成的。
[0010]进一步优选的，所述含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液包括氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、磷酸二氢钾0.24g/L，所述含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液的pH值为8.0，所述含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液中的二甲基亚砜的重量百分比为1％。
[0011]优选的，所述粘附肽原溶液中粘附肽的浓度为0.5～2mg/mL，更进一步优选为1mg/mL。
[0012]优选的，所述链霉亲和素
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荧光素复合物为采用下述方法制得：
[0013]将荧光素溶于硼酸盐缓冲液A中，再加入碳二亚胺盐酸盐和N
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羟基硫代琥珀酰亚胺，反应3～10min，调节溶液的pH值至8.0～8.5后加入链霉亲和素，混匀后持续反应1～3h；向所得的溶液中加入含5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭5～20min终止反应，经离心、除去沉淀后，用硼酸盐缓冲液B在截留分子量100K的超滤离心管中洗涤得到链霉亲和素
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荧光素复合物。
[0014]进一步优选的，所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明
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异硫氰酸中的至少一种。
[0015]进一步优选的，所述硼酸盐缓冲液A的pH值为5.0～6.0，更进一步优选为5.5。
[0016]进一步优选的，所述荧光素、碳二亚胺盐酸盐和N
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羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1000:2000。
[0017]进一步优选的，所述链霉亲和素与荧光素的摩尔比为20:1。
[0018]进一步优选的，所述硼酸盐缓冲液B的pH值为6.5～7.5，更进一步优选为7.0。
[0019]优选的，所述渗透剂为二甲基亚砜、二甲基乙酰胺中的至少一种。
[0020]优选的，所述稳定剂为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠中的至少一种。
[0021]优选的，所述抗淬灭剂为丙三醇、抗坏血酸中的至少一种。
[0022]优选的，所述特异性白念珠真菌荧光染色液还含有保湿剂。
[0023]进一步优选的，所述保湿剂为丙三醇、丁二醇中的至少一种。
[0024]第二方面，本专利技术提供的一种如第一方面所述的特异性白念珠真菌荧光染色液的制备方法，包括如下步骤：
[0025](1)将粘附肽原液与链霉亲和素荧光素复合物，在室温下孵育10～40min，摇晃彻底，并进行避光保存，得到复合物溶液；
[0026](2)将所得的复合物溶液、稳定剂、抗淬灭剂、渗透剂和水混合均匀后，定容至1L即得特异性白念珠真菌荧光染色液。
[0027]第三方面，本专利技术提供的一种特异性白念珠真菌的检测方法，包括如下步骤：
[0028](1)将待测的含有微生物的样本稀释液移至载玻片中间区域，制片完成；
[0029](2)将如第一方面所述的特异性白念珠真菌荧光染色液滴加到样本稀释液进行覆盖，在25～37℃下孵育5～30min即可完成染色；
[0030](3)取盖玻片直接加盖染色完成的载玻片，吸取多余液体；
[0031](4)取样片载玻片于荧光显微镜下以400～600nm的波段进行观测白念珠菌群的形态及荧光强度。
[0032]为了便于理解本专利技术，现对本专利技术中的相关原理作进一步解释，具体如下：
[0033]白念珠菌在获得致病性条件侵染宿主之前，会先由酵母态转换为假丝态生长出菌丝。这种菌丝状态促进了白念珠菌的侵染能力，同时协助白念珠菌逃逸宿主的免疫。假丝态使白念珠菌获得强侵染能力的原因之一就是在菌丝结构中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性白念珠真菌荧光染色液，其特征在于，每1L特异性白念珠真菌荧光染色液中含有：粘附肽原液0.05～0.15g、链霉亲和素
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荧光素复合物0.05～1g、渗透剂5～25g、稳定剂30～225g、抗猝灭剂0.5～25g。2.根据权利要求1所述的特异性白念珠真菌荧光染色液，其特征在于，所述粘附肽原溶液是由粘附肽粉末和含有二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液配制成的。3.根据权利要求1所述的特异性白念珠真菌荧光染色液，其特征在于，所述粘附肽原溶液中粘附肽的浓度为0.5～2mg/mL。4.根据权利要求1所述的特异性白念珠真菌荧光染色液，其特征在于，所述链霉亲和素
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荧光素复合物为采用下述方法制得：将荧光素溶于硼酸盐缓冲液A中，再加入碳二亚胺盐酸盐和N
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羟基硫代琥珀酰亚胺，反应3～10min，调节溶液的pH值至8.0～8.5后加入链霉亲和素，混匀后持续反应1～3h；向所得的溶液中加入含5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭5～20min终止反应，经离心、除去沉淀后，用硼酸盐缓冲液B在截留分子量100K的超滤离心管中洗涤得到链霉亲和素
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荧光素复合物。5.根据权利要求4所述的特异性白念珠真菌荧光染色液，其特征在于，所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏成康，陶成龙，
申请(专利权)人：广州浩康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：