一种抗PD-1单克隆抗体制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，本发明专利技术提供了以高亲和力与人PD-1结合的抗体或功能性片段，还提供了编码本发明专利技术抗体或功能性片段的氨基酸序列，包括本发明专利技术抗体的轻重链及互补决定区氨基酸序列，包括用于表达本发明专利技术抗体或其功能性片段的表达载体和宿主细胞以及本发明专利技术抗体或其功能性片段的生产方法；本发明专利技术提供的抗体亲和力高，阻断PD-1/PD-L1信号通路，在人类肿瘤治疗方面发挥重要作用。治疗方面发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种抗PD-1单克隆抗体


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种抗PD-1单克隆抗体。

技术介绍

[0002]程序性死亡受体-1(Programmed Death-1，PD-1)是一类重要的免疫负调控分子(也称为“免疫检查点分子”)，属于CD28家族成员，结构上，该分子由288个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成。其中，PD-1分子的胞外区是一个免疫球蛋白样可变区(IgV)结构域，胞内区含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif,ITIM)和一个免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif,ITSM)，ITSM是PD-1分子向胞内传递抑制信号的关键基序。PD-1主要表达于CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK-T细胞、B细胞和活化的单核细胞表面，PD-1是在活化T细胞和B细胞表面表达的免疫抑制性受体(Okazaki et al.Current Opinion in Immunology.2002,14:779-782；Bennett et al.J Immunol.2003,170:711-718)，主要受T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)信号的诱导表达；在调节免疫系统中的激活和抑制信号中发挥重要作用(Okazaki,Taku et al.International Immunology.2007,19(7):813-824)。
[0003]PD-1具有两个配体PD-L1和PD-L2，PD-L1是由290个氨基酸组成的跨膜蛋白，胞外区具有两个免疫球蛋白的恒定区IgV以及IgC样结构域。其主要表达于成熟的巨噬细胞、B细胞、CD4-T细胞、树突细胞上，并在肿瘤细胞中高表达。PD-L2是由270个氨基酸组成的跨膜蛋白，但是PD-L2表达区域却极其有限，仅在巨噬细胞和树突细胞中存在，被认为主要在免疫呈递中起作用；其与PD-L1均属于B7配体家族，有34％的同源性，此外两者有着类似该家族其他成员的共同结构基础。PD-1能够与其配体(PD-L1和PD-L2)相互作用，通过细胞内信号转导通路显著抑制CD3和CD28介导的T细胞活化以及细胞因子产生，因此是调节T细胞反应的重要免疫哨卡。在正常情况下，PD-1/PD-Ls信号通路可以诱导和维持外周组织的免疫耐受，对防止组织的过度炎症反应以及自身免疫性疾病的发生具有积极作用；在肿瘤和病毒感染时，细胞PD-L1和PD-L2表达上调，与T细胞表面的PD-1受体相互作用，能够抑制T细胞的活化、增殖以及抑制对肿瘤的杀伤，使T细胞功能发生紊乱；在肿瘤的发生中，肿瘤细胞表达的PD-L1与PD-1结合后，对淋巴细胞产生抑制作用，会抑制生长因子的生成和细胞增殖，下调T细胞免疫刺激性细胞因子如IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌以及存活蛋白的表达，促进免疫抑制性细胞因子IL-10分泌，而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。PD-1/PD-L1信号通路与肿瘤发展有着密切关系，在肿瘤患者体内，PD-L1高表达能增强肿瘤的转移能力，导致患者死亡率上升，并且与患者预后不良相关。研究发现在肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌及头颈癌等人类肿瘤组织中都检测到高表达的PD-L1蛋白。用阻断型抗PD-1单抗阻断PD-1/PD-L1信号可以通过上调IFN-γ、IL-2、IL-10分泌，并有效逆转CD4+和CD8+T细胞的增殖抑制，同时使T细胞的活化程度和杀伤能力显著增强。
[0004]由于PD-1抗体的广谱肿瘤前景和惊人的药效，业界普遍认为针对PD-1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性进展。已有PD-1/PD-L1抗体被美国FDA批准用于近十种肿瘤的治疗，包括：黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、胃癌、肝癌、霍奇金淋巴瘤和MSI-H的实体瘤等。目前美国FDA批准上市的抗PD-1/PD-L1单抗药物有6种，其中抗PD-1单抗有Pembrolizumab、Nivolumab、Pidilizumab；抗PD-L1单抗有Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab，其中Pembrolizumab更是成为首款“广谱抗癌药”。目前国内有4款国产抗PD-1抗体获批上市，分别为信达生物的信迪单抗、君实生物的特瑞普利单抗、百济神州的替雷利珠单抗和恒瑞的卡瑞利珠单抗。
[0005]然而，目前仍需要开发出新的具有更好结合效率的抗PD-1抗体，以有效地阻断PD-1/PD-L1信号通路，发挥抗肿瘤作用。

技术实现思路

[0006]本专利技术基于PD-1/PD-L1在肿瘤发生发展中的作用机制，从而提供一种抗PD-1抗体，其与程序性死亡因子1(PD-1)结合并表现出许多优良特性，这些特性包括例如与人PD-1以高亲和力结合，具有良好的生物活性，能够阻断PD-1/PD-L1信号通路，抑制体内肿瘤细胞的生长从而发挥抗肿瘤作用。
[0007]本专利技术第一方面，本专利技术涉及抗PD-1抗体或抗原结合片段，所述抗体优选表现出以下特征中的一个或更多个：
[0008](a)抑制PD-1与PD-L1结合；
[0009](b)以1.0
×
10-10
M或更高的亲和力结合人PD-1；
[0010](c)阻断PD-1/PD-L1信号通路；
[0011](d)具有较强的生物学活性；
[0012](e)抑制体内肿瘤细胞的生长。
[0013]优选地，本专利技术所述抗体优选为人源化抗体，在可选的实施例方案中抗PD-1抗体还可以为小鼠抗体或嵌合抗体或人抗体。
[0014]优选地，所述抗体以2.5
×
10-12
M或更低的KD结合人PD-1；
[0015]更优选地，所述抗体以1.82
×
10-12
M或更低的KD结合人PD-1。
[0016]本专利技术的第二个方面，提供了一种特异性结合PD-1的单克隆抗体或抗原结合片段，本专利技术抗体或抗原结合片段具有轻链可变区和重链可变区。
[0017]在一些具体实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区；以及含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，其中
[0018]优选地，所述抗体可变区包含：
[0019](1)VL结构域，其包含的LCDR1、LCDR2、LCDR3分别如SEQ ID NO：17、18、19所示；和
[0020](2)VH结构域，其包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别如SEQ ID NO：20、21、22所示；或
[0021](3)与(1)～(2)所述序列相比具有一个以上氨基酸保守性修饰的氨基酸序列，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗PD-1单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含：(1)VL结构域，其包含的LCDR1、LCDR2、LCDR3分别如SEQ ID NO：17、18、19所示；和(2)VH结构域，其包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别如SEQ ID NO：20、21、22所示或；或(3)与(1)～(2)所述序列相比具有一个或更多个氨基酸保守突变的氨基酸序列，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的序列。2.根据权利要求1所述一种抗PD-1单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含：(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的VL结构域，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的序列，或具有一个或更多个氨基酸取代的序列。(2)氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示的VH结构域，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的序列，或具有一个或更多个氨基酸取代的序列。3.根据权利要求1所述一种抗PD-1单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体可以是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。4.一种鼠源抗PD-1单克隆抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含：(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的VL结构域，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性或同源性的序列，或具有一个或更多个氨基酸取代的序列；和(2)氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的VH结构域，或与所述序列具有至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贵民，赵丽丽，李振宇，朱中松，刘忠，
申请(专利权)人：鲁南制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：