一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法技术

本发明专利技术涉及培养基技术领域，且公开了一种改良的新生猪胰岛细胞培养基，是基础培养基DMEM中还含有占培养基体积8

【技术实现步骤摘要】
一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法


[0001]本专利技术涉及培养基领域，尤其涉及一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法。

技术介绍

[0002]I型糖尿病是全世界公认最具威胁的慢性代谢疾病之一，其特点为选择性免疫介导破坏胰岛β细胞，使患者终身需要外源性胰岛素治疗。该疾病晚期爆发各种并发症，将导致患者生活及经济负担的极具加重和高死亡率。自从埃德蒙顿方案成功实施后，胰岛移植受到举世瞩目。在总结全球的胰岛移植研究成果基础后，促进移植方法和免疫抑制方案的改进，为I型糖尿病患者带来了希望。人类胰腺胰岛同种异体移植已经被证实是一种可行的治疗I型糖尿病的方法。移植之后可以改善和控制患者血糖，减少对胰岛素的需求，并降低低血糖症发生几率。但人胰岛来源之困难，胰岛分离纯化技术之不完善，存在疾病传播之风险，使得人胰岛移植有很大的局限性。
[0003]人们积极寻找相应的替代品来解决组织材料匮乏的问题，猪胰岛素与人胰岛素结构极其相似，仅一个非保守氨基酸差异，既不影响胰岛素长度，也不影响与受体的结合发挥正常的生理功能，尤其是新生猪胰岛细胞的血糖调定点同人相近，是替代人类胰岛治疗糖尿病的首选供体。1994年，瑞典的Groth教授开异种胰岛移植之先河，首次利用新生猪胰岛细胞团(NPCCs)作为供体，进行治疗人类I型糖尿病的尝试，取得一定临床疗效，世界移植领域为之震动。到目前为止，我们熟练掌握了NPCCs的分离和纯化，纯化后NPCCs由大约75.2％原始导管细胞、19.6％内分泌细胞和9.5％间质细胞组成。NPCCs需要一段时间逐步发育，其中的原始导管细胞才能转化为内分泌细胞，原始内分泌细胞也趋于成熟，可供实验﹑治疗之用。关于以何种培养体系培养NPCCs能使其大量转化为β细胞有很多争论，转化率和分泌胰岛素功能有待提升。
[0004]为解决上述问题，本申请中提出一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法。

技术实现思路

[0005](一)专利技术目的
[0006]为解决
技术介绍
中存在的技术问题，本专利技术提出一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法，本专利技术使得NPCCs中β细胞发育成熟，使得胰岛素刺激释放量提高。
[0007](二)技术方案
[0008]为解决上述问题，本专利技术提供了一种改良的新生猪胰岛细胞培养基，是基础培养基DMEM中还含有占培养基体积8
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11％的胎牛血清和双抗、1.5
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2.5mmol/L谷氨酰胺、0.05
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0.15％大豆胰酶抑制剂、6
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13mmol/L烟碱、7
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12ng/mL表皮细胞生长因子、10
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20ng/mL胰岛素样生长因子。
[0009]优选的，是基础培养基DMEM中还含有占培养基体积8
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9.5％的胎牛血清和双抗、
1.5
‑
2mmol/L谷氨酰胺、0.05
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0.1％大豆胰酶抑制剂、6
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9.5mmol/L烟碱、7
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9.5ng/mL表皮细胞生长因子、10
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15ng/mL胰岛素样生长因子。
[0010]优选的，是基础培养基DMEM中还含有占培养基体积9.5
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11％的胎牛血清和双抗、2
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2.5mmol/L谷氨酰胺、0.1
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0.15％大豆胰酶抑制剂、9.5
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13mmol/L烟碱、9.5
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12ng/mL表皮细胞生长因子、15
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20ng/mL胰岛素样生长因子。
[0011]培养基在新生猪胰岛细胞中的应用。
[0012]改良的新生猪胰岛细胞培养基的使用方法如下：
[0013]改良的新生猪胰岛细胞培养基中接种浓度为4000
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7500IEQ/20
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27mL，在38℃、5％二氧化碳、饱和湿度培养箱内培养。
[0014]培养时在第一天更换培养基和培养皿，此后每隔一天更换一次，培养至7
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14天。
[0015]本专利技术的上述技术方案具有如下有益的技术效果：
[0016]使得NPCCs中β细胞发育成熟及CK7阳性细胞向β细胞转化，并使胰岛素刺激释放量提高。
具体实施方式
[0017]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本专利技术进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本专利技术的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本专利技术的概念。
[0018]实施例1
[0019]一种改良的新生猪胰岛细胞培养基，是基础培养基DMEM中还含有占培养基体积10％的胎牛血清和双抗、2mmol/L谷氨酰胺0.1％大豆胰酶抑制剂、8.5mmol/L烟碱、9ng/mL表皮细胞生长因子、15ng/mL胰岛素样生长因子。
[0020]实施例2
[0021]一种改良的新生猪胰岛细胞培养基，是基础培养基DMEM中还含有占培养基体积8％的胎牛血清和双抗、1.5mmol/L谷氨酰胺、0.05％大豆胰酶抑制剂、6mmol/L烟碱、7ng/mL表皮细胞生长因子、10ng/mL胰岛素样生长因子。
[0022]实施例3
[0023]一种改良的新生猪胰岛细胞培养基，是基础培养基DMEM中还含有占培养基体积11％的胎牛血清和双抗、2.5mmol/L谷氨酰胺、0.15％大豆胰酶抑制剂、13mmol/L烟碱、12ng/mL表皮细胞生长因子、20ng/mL胰岛素样生长因子。
[0024]实施例4
[0025]选取实施例1、实施例2和实施例3培养14天后NPCCs的胰岛素刺激释放量如下表
[0026][0027][0028]促成熟转化原因：
[0029]加入了烟碱(NIC)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF
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1)，3种因子协同作用加快了NPCCs的发育进程，分析原因如下：NIC有促进细胞贴壁﹑减少成纤维细胞污染，促进原始细胞向β细胞分化作用。早在1993年Korsgren外国友人，发现NIC能促进原始细胞向β细胞分化，还发现NIC有促进细胞贴壁、减少成纤维细胞污染的功能，NIC对胰腺细胞的分离培养作用较多，多数实验证明，NIC能诱导胎猪的细胞向β细胞分化，用于移植前胰岛细胞成熟。用NIC处理胎儿胰腺细胞能增加胰岛素和其DNA量(促胰岛素原和有丝分裂)将未分化的上皮细胞转化为β细胞，并增加胰岛素﹑胰高血糖素﹑生长抑素等基因表达。随着胰岛移植治疗糖尿病的开展，NIC对移植胰岛的体外成熟作用日益受到重视，直到现在，NIC已成为胰岛诱导成熟的公认试剂。NIC是一种ADP
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核糖合成酶抑制剂13，通过抑制脲链密啶诱导激活ADP多核糖聚合酶活性，阻止DNA烷化、羟化对DNA链断裂而保护胰岛细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改良的新生猪胰岛细胞培养基，其特征在于，是基础培养基DMEM中还含有占培养基体积8
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11％的胎牛血清和双抗、1.5
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2.5mmol/L谷氨酰胺、0.05
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0.15％大豆胰酶抑制剂、6
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13mmol/L烟碱、7
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12ng/mL表皮细胞生长因子、10
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20ng/mL胰岛素样生长因子。2.根据权利要求1所述的一种改良的新生猪胰岛细胞培养基，其特征在于，是基础培养基DMEM中还含有占培养基体积8
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9.5％的胎牛血清和双抗、1.5
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2mmol/L谷氨酰胺、0.05
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0.1％大豆胰酶抑制剂、6
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9.5mmol/L烟碱、7
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9.5ng/mL表皮细胞生长因子、10
‑
15ng/mL胰岛素样生长因子...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧勤，
申请(专利权)人：湖南晨曦牧业有限公司，
类型：发明
国别省市：