【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于MERFISH和其他应用的扩增方法和系统
[0001]相关申请
[0002]本申请要求Zhuang等人于2018年12月13日提交的题为“Amplification Methods and Systems for MERFISH and Other Applications”的美国临时专利申请系列号62/779,333的权益，该申请通过引用整体并入本文。
[0003]政府资助
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的MH113094、MH111502和MH114830下由政府支持完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。
[0005]本专利技术一般涉及用于对细胞或其他样品中的核酸进行成像或测定的系统和方法。
技术介绍
[0006]单分子荧光原位杂交(smFISH)通过直接检测单个细胞中的个体RNA分子来提供RNA丰度和空间位置。通过使用这样的技术，RNA定位已被证明与多种细胞功能相关，例如发育中的身体模式化、细胞分裂过程中的细胞命运决定、局部翻译、细胞迁移和极性的建立。为了研究完整细胞和组织内转录组规模上的RNA定位，已开发出多重化抗错荧光原位杂交(MERFISH)和原位测序。其中，MERFISH使用抗错二进制条形码化和顺序成像来在高检测效率的情况下多重化smFISH测量。然而，信号的更高光子计数将改善受成像采集速度限制的通量、深部组织成像引起的光散射以及样品自发荧光导致的低信号背景比。因此，需要在增加光子计数方面的改进，以允许成像通量的显著增加、可能不允许足够探针的结合以
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种方法，其包括：将样品暴露于核酸探针；将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中最大数量的初级扩增器核酸能够结合核酸探针；将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中最大数量的次级扩增器核酸能够结合初级扩增器核酸；使用荧光确定样品内核酸探针的分布；基于样品内的荧光分布创建代码字；和对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。2.权利要求1的方法，其包括将所述样品暴露于至少5种不同的核酸探针。3.权利要求1或2中任一项的方法，其包括将所述样品暴露于至少10种不同的核酸探针。4.权利要求1
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3中任一项的方法，其包括将所述样品暴露于至少100种不同的核酸探针。5.权利要求1
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4中任一项的方法，其包括将所述样品顺序地暴露于多个核酸探针。6.权利要求1
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5中任一项的方法，其中所述多个核酸探针包括具有不同序列的核酸探针的组合性组合。7.权利要求6的方法，其中核酸探针的组合性组合靶向样品中RNA种类的组合性组合。8.权利要求6或7中任一项的方法，其中核酸探针的组合性组合靶向样品中DNA序列的组合性组合。9.权利要求1
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8中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些包含DNA。10.权利要求1
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9中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些包含RNA。11.权利要求1
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10中任一项的方法，其中所述多个核酸探针的平均长度为10至300个核苷酸。12.权利要求1
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11中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些被配置为结合所述样品内的核酸。13.权利要求1
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12中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些包含靶序列和一个或多个读取序列。14.权利要求13的方法，其中所述多个核酸探针的靶序列的平均长度为10至200个核苷酸。15.权利要求13或14中任一项的方法，其中所述靶序列与编码蛋白质的核酸序列基本上互补。16.权利要求13
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15中任一项的方法，其中所述靶序列通过特异性结合与靶标结合。17.权利要求16的方法，其中所述靶标包括RNA。18.权利要求17的方法，其中所述RNA包括非编码RNA。19.权利要求17或18中任一项的方法，其中所述RNA包括mRNA。20.权利要求17
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19中任一项的方法，其中所述RNA包括转移RNA(tRNA)。21.权利要求17
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20中任一项的方法，其中所述RNA包括核糖体RNA(rRNA)。
22.权利要求16
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21中任一项的方法，其中所述靶标包括DNA。23.权利要求22的方法，其中所述DNA包括基因组DNA。24.权利要求13
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23中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸通过所述读取序列结合所述核酸探针。25.权利要求13
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24中任一项的方法，其中所述多个核酸探针包括由一个或多个读取序列的集合的组合性组合形成的可区分的核酸探针。26.权利要求25的方法，其中所述集合具有至少8个可能的读取序列。27.权利要求25或26中任一项的方法，其中所述集合具有至少16个可能的读取序列。28.权利要求25
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27中任一项的方法，其中所述集合具有至少24个可能的读取序列。29.权利要求25
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28中任一项的方法，其中所述集合具有至少32个可能的读取序列。30.权利要求25
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29中任一项的方法，其中所述集合具有至少48个可能的读取序列。31.权利要求25
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30中任一项的方法，其中所述集合具有至少64个可能的读取序列。32.权利要求25
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31中任一项的方法，其中所述集合具有不超过32个可能的读取序列。33.权利要求25
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32中任一项的方法，其中所述集合具有不超过16个可能的读取序列。34.权利要求25
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33中任一项的方法，其中所述多个读取序列分布在所述多个核酸探针上以定义错误校正码。35.权利要求13
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34中任一项的方法，其中所述读取序列的平均长度为5个核苷酸至50个核苷酸。36.权利要求13
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35中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些包含不超过10个读取序列。37.权利要求13
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36中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些包含不超过5个读取序列。38.权利要求1
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37中任一项的方法，其中不超过20个初级扩增器核酸能够结合所述核酸探针。39.权利要求1
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38中任一项的方法，其中不超过10个初级扩增器核酸能够结合所述核酸探针。40.权利要求1
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39中任一项的方法，其中不超过5个初级扩增器核酸能够结合所述核酸探针。41.权利要求1
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40中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸具有小于300个核苷酸的平均长度。42.权利要求1
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41中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸具有小于200个核苷酸的平均长度。43.权利要求1
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42中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸具有所述次级扩增器核酸能够结合的重复序列。44.权利要求1
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43中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸各自靶向所述初级扩增器核酸上少于10个核苷酸的序列。45.权利要求1
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44中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成。46.权利要求1
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45中任一项的方法，其中不超过20个次级扩增器核酸能够结合初级扩
增器核酸。47.权利要求1
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46中任一项的方法，其中不超过10个次级扩增器核酸能够结合初级扩增器核酸。48.权利要求1
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47中任一项的方法，其中不超过5个次级扩增器核酸能够结合初级扩增器核酸。49.权利要求1
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48中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸具有小于300个核苷酸的平均长度。50.权利要求1
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49中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸具有小于200个核苷酸的平均长度。51.权利要求1
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50中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成。52.权利要求1
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51中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸包含荧光信号传导实体。53.权利要求1
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52中任一项的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。54.权利要求52或53中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。55.权利要求52
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54中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体通过二硫键与所述次级扩增器核酸连接。56.权利要求1
‑
51中任一项的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于能够与所述次级扩增器核酸结合的三级扩增器核酸。57.权利要求56的方法，其中所述三级扩增器核酸包含荧光信号传导实体。58.权利要求56的方法，其还包括将所述三级扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。59.权利要求57或58中任一项的方法，其中所述三级扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。60.权利要求56的方法，其还包括将所述三级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。61.权利要求60的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。62.权利要求60的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。63.权利要求61或62中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。64.权利要求52
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55、57
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59或61
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63中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体包括蛋白质。65.权利要求52
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55、57
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59或61
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64中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体包括染料。66.权利要求52
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55、57
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59或61
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65中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体包括Alexa Fluor 750。67.权利要求52、52
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55、57
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59或61
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66中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体包括Cy5。68.权利要求52
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55、57
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59或61
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67中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体包括
纳米颗粒。69.权利要求52
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55、57
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59或61
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68中任一项的方法，其包括在所述样品暴露于核酸探针之间灭活所述荧光信号传导实体。70.权利要求69的方法，其包括通过去除所述荧光信号传导实体来灭活所述荧光信号传导实体。71.权利要求69或70中任一项的方法，其包括使用还原剂灭活所述荧光信号传导实体。72.权利要求69
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71中任一项的方法，其包括使用二硫键裂解灭活所述荧光信号传导实体。73.权利要求69
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72中任一项的方法，其包括通过光漂白所述荧光信号传导实体来灭活所述荧光信号传导实体。74.权利要求69
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73中任一项的方法，其包括通过化学漂白所述荧光信号传导实体来灭活所述荧光信号传导实体。75.权利要求69
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74中任一项的方法，其包括通过酶促切割所述荧光信号传导实体来灭活所述荧光信号传导实体。76.权利要求1
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75中任一项的方法，其中所述多个核酸探针限定具有至少2的汉明距离的代码空间。77.权利要求76中任一项的方法，其中所述多个核酸探针限定具有至少3的汉明距离的代码空间。78.权利要求76或77中任一项的方法，其中所述代码空间是汉明(7,4)代码、汉明(15,11)代码、汉明(31,26)代码、汉明(63,57)代码或汉明(127,120)代码。79.权利要求76
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78中任一项的方法，其中所述代码空间是SECDED代码。80.权利要求79的方法，其中所述代码空间是SECDED(8,4)代码、SECDED(16,4)代码、SECDED(16,11)代码、SECDED(22,16)代码、SECDED(39,32)代码或SECDED(72,64)代码。81.权利要求76
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80中任一项的方法，其中所述核酸探针限定仅具有恒定数量的代码空间。82.权利要求1
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81中任一项的方法，其包括通过对所述样品的至少一部分进行成像来确定核酸探针的分布。83.权利要求82的方法，其包括使用光学成像技术确定核酸探针的结合。84.权利要求82或83中任一项的方法，其包括使用荧光成像技术确定核酸探针的结合。85.权利要求82
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84中任一项的方法，其包括使用多色荧光成像技术确定核酸探针的结合。86.权利要求82
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85中任一项的方法，其包括使用超分辨率荧光成像技术确定核酸探针的结合。87.权利要求86的方法，其包括使用随机光学重建显微术(STORM)确定核酸探针的结合。88.权利要求82
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87中任一项的方法，其包括使用用于确定非重叠的单发射体的算法来确定所述次级扩增器核酸的图像的质心。89.权利要求82
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88中任一项的方法，其包括使用用于确定部分重叠的单发射体的算法来确定所述次级扩增器核酸的图像的质心。
90.权利要求88或89中任一项的方法，其还包括确定所述次级扩增器核酸的置信水平。91.权利要求90的方法，其包括使用精确匹配的数量与具有针对代码字的一个或多个一位错误的匹配的数量的比率来确定所述置信水平。92.权利要求90或91中任一项的方法，其包括使用精确匹配的数量与具有针对代码字的恰好一个一位错误的匹配的数量的比率来确定所述置信水平。93.权利要求82
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92的方法，其包括以优于300nm的分辨率确定样品内核酸探针的分布。94.权利要求82
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93的方法，其包括以优于100nm的分辨率确定样品内核酸探针的分布。95.权利要求82
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94的方法，其包括以优于50nm的分辨率确定所述样品内核酸探针的分布。96.权利要求1
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95中任一项的方法，其中所述样品包括细胞。97.权利要求96的方法，其中所述细胞是人类细胞。98.权利要求96
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97中任一项的方法，其中所述细胞是固定的。99.权利要求1
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98中任一项的方法，其中所述样品包括组织。100.一种方法，其包括：将样品暴露于核酸探针；将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸和次级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的；使用荧光确定样品内核酸探针的分布；基于样品内的荧光分布创建代码字；和对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。101.权利要求100的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。102.权利要求101的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。103.权利要求101的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。104.权利要求102或103中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。105.一种方法，其包括：将样品暴露于核酸探针；将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中所述次级扩增器核酸在固定距离内结合所述初级扩增器核酸；使用荧光确定样品内核酸探针的分布；基于样品内的荧光分布创建代码字；和对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。106.权利要求105的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
107.权利要求106的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。108.权利要求106的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。109.权利要求107或108中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。110.一种方法，其包括：将样品暴露于核酸探针；将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成；将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸；使用荧光确定样品内核酸探针的分布；基于样品内的荧光分布创建代码字；和对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。111.权利要求110的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。112.权利要求111的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。113.权利...
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