基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法。本发明专利技术通过LAMP对副溶血弧菌的特征基因进行扩增，利用Cas12a和crRNA组装的复合物识别并结合LAMP扩增的特异产物上的特征序列以激活Cas12a的附属切割活性，从而对G四联体进行切割，使其无法与硫磺素T(ThT)结合并丧失增强荧光的能力，最终将副溶血弧菌的基因信息转换为可视的荧光变化。本发明专利技术实现了对副溶血弧菌基因的特异、免标记、可视化检测。可视化检测。可视化检测。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法


[0001]本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及了一种利用CRISPR/Cas12a切割G四联体并调节硫磺素T(ThT)的荧光发射而实现特异、免标记且可视地检测副溶血弧菌的方法。

技术介绍

[0002]副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种主要的食源性致病菌。人们食用被副溶血弧菌污染的食物后极可能会引起以腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热等为主要症状的急性肠胃炎。副溶血弧菌广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中。目前，副溶血弧菌成为我国主要的食源性致病菌，且因副溶血弧菌污染而引起的食物中毒事件已在数量上超过沙门氏菌。特别是在一些沿海城市，由该菌引起的食物中毒事件占细菌性食物中毒总数的60％以上。因此，为了保证食品安全，准确、高效地检测副溶血弧菌也变得越来越重要。
[0003]食品中副溶血弧菌的常规检测方法是平板培养法，包括菌落计数和标准生化鉴定，一般需要2到3天对致病菌进行初步鉴定，额外需要长达一周的时间进一步确认致病菌的种类，检测周期长，工作量大。免疫学检测方法主要是基于抗原和抗体间的相互作用而实现的，相比于传统的平板培养分离鉴定法检测时间已经大幅度缩短，但抗原和抗体之间的结合强度及细菌抗原交叉反应常影响检测结果的灵敏度和准确性。基于生物遗传信息发展起来的核酸检测技术具有特异性强、灵敏度高等优点，如聚合酶链式反应(PCR)。但PCR需要精密的温控设备，不适用于现场检测。
[0004]环介导等温扩增(LAMP)不需要模板的热变性，在等温条件下即可实现目标序列的指数复制，仅简单的金属浴或水浴锅即可满足温控需求，避免对昂贵的仪器设备的依赖，具有省时、易操作、低成本的特点，且灵敏度极高。常规用于LAMP检测的方法主要包括实时荧光采集和凝胶电泳，前者需要精密的荧光采集装置，后者操作时间长，两者在现场检测领域都受到一定的限制。可视化检测法具有操作方便、结果直观等优点，在现场检测领域具有巨大的优势。LAMP体系中各成分(如焦磷酸根离子、镁离子、氢离子等)在反应前后发生较大幅度变化，常被用于构建可视化判断LAMP反应进程的方法，例如HNB法、钙黄绿素法、浊度法、pH染料法等。但引物设计、反应温度、缓冲溶液、酶等任一因素的非最佳条件都可能导致LAMP反应过程中非特异性核酸链延伸与积累，而上述方法无法排除非特异信号所产生的干扰，进而影响检测结果的准确性。
[0005]CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是一种存在于几乎所有古生菌和多数细菌中的抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。Cas12a是一种与CRISPR相关的DNA内切酶，在crRNA的引导下依赖PAM序列特异性识别双链DNA序列，形成三体复合物。与此同时，Cas12a的附属切割活性被激活，不加选择地切割体系中的所有单链DNA。CRISPR/Cas12a的这种特性已被成功应用于开发快速、低成本且高灵敏的核酸检测工具上，在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。但
是，CRISPR/Cas12a仅能检测pM甚至更高浓度的核酸序列，其灵敏度无法满足实际生产中副溶血弧菌的检测需求。利用LAMP的高灵敏度的特点，将其与CRISPR/Cas技术联用，能够很好的解决CRISPR自身灵敏度受限的问题，并排除LAMP的非特异信号的干扰，实现副溶血弧菌的特异检测。但是，当前利用CRISPR/Cas进行目标物检测时，主要依赖Cas12a对荧光/淬灭基团或纳米材料标记的单链DNA进行切割，检测成本较高。
[0006]G四联体是由富G序列形成的特定空间结构，当其与一些特定的荧光染料如酞菁染料、三苯甲烷、卟啉衍生物、结晶紫等结合后，能够很大程度地增强染料自身的荧光强度。其增强的原理是，荧光分子之间相互靠近后会发生自淬灭的现象，而G四联体形成的空间结构能够给染料分子提供一个疏水环境，防止他们相互靠近，导致荧光淬灭。当富G序列被切断时，无法形成四联体结构，其结合上述荧光染料的能力丧失，荧光增强效应消失。本申请将G四联体
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硫磺素T(ThT)与CRISPR/Cas12a耦联，利用Cas12a的附属切割活性切割G四联体，从而抑制ThT的荧光发射，并通过荧光信号变化实现对副溶血弧菌可视检测。

技术实现思路

[0007]为了解决基于CRISPR/Cas12a的核酸检测依赖纳米材料或荧光标记的问题，本专利技术提供了一种利用CRISPR/Cas12a切割G
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四联体，使其无法结合ThT而不能增强ThT的荧光发射，实现副溶血弧菌基因检测的方法。
[0008]本专利技术采用的技术方案包括以下步骤：
[0009]1)提取待测样品的基因组DNA；
[0010]2)表达并纯化Cas12a；
[0011]3)设计crRNA和LAMP引物；
[0012]4)LAMP扩增：以步骤1)提取的基因组DNA作为模板，在含有LAMP引物的LAMP体系中进行扩增，得到LAMP产物；
[0013]5)荧光可视检测：将含有LAMP产物、Cas12a、crRNA、硫磺素T(ThT)、富G序列和NEBuffer2.1缓冲液混匀后，孵育10～60min，通过荧光可视检测样品中是否含有副溶血弧菌基因。
[0014]所述步骤3)中设计LAMP引物具体为：针对副溶血弧菌的Tlh基因合成LAMP引物，所述LAMP引物包括内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1和环引物2。
[0015]所述步骤3)中设计crRNA具体为：
[0016]根据LAMP的靶标序列以及PAM序列(TTTN)选定crRNA的识别序列为TGTTCTACACCAACACGTCGCAAA；
[0017]然后根据碱基互补配对的原则设计并合成对应的crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGACGUGUUGGUGUAGAACA。
[0018]所述步骤4)中：
[0019]LAMP体系包括2μL模板DNA、1.6μM内引物1和内引物2、0.2μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4mM dNTPs、8U Bst DNA Polymerase Large Fragment和1
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NEBuffer2.1；
[0020]扩增条件为：65℃孵育60min。
[0021]所述步骤5)中：
[0022]LAMP扩增产物的体积为1
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10μL，Cas12a的浓度为200nM
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500nM，crRNA的浓度为300nM
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750nM，富G序列的浓度为150nM
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750nM，ThT浓度为8.0μM
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25.0μM。
[0023]所述步骤5)中的孵育温度为35
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测样品的基因组DNA；2)表达并纯化Cas12a；3)设计crRNA和LAMP引物；4)LAMP扩增：以步骤1)提取的基因组DNA作为模板，在含有LAMP引物的LAMP体系中进行扩增，得到LAMP产物；5)荧光可视检测：将含有LAMP产物、Cas12a、crRNA、硫磺素T、富G序列和NEBuffer2.1缓冲液混匀后，孵育10～60min，通过荧光可视检测样品中是否含有副溶血弧菌基因。2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤3)中设计LAMP引物具体为：针对副溶血弧菌的Tlh基因合成LAMP引物，所述LAMP引物包括内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1和环引物2。3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤3)中设计crRNA具体为：根据LAMP的靶标序列以及PAM序列选定crRNA的识别序列为TGTTCTACACCAACACGTCGCAAA；然后根据碱基互补配对的原则设计并合成对应的crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGACGUGUUGGUGUAGAACA。4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a的免标记可视化检测副溶血弧菌基因的方法，其特征在于，所述步骤4)中：LAMP体系包括2μL模板DNA、1.6μM内引物1和内引物2、0.2μM外引物1和外引物2、0.4μM环引物1和环引物2、1.4mM dNTPs、8U Bst DNA P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王柳，陈雪雲，何开雨，徐霞红，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：