一种提高青霉素产量的物理刺激方法技术

本发明专利技术公开了一种提高青霉素产量的物理刺激方法。它包括如下步骤：1)制备大气压低温等离子体活化水PAW，进一步形成大气压低温等离子体活化固态培养基PASM以及大气压低温等离子体活化微泡PAB；2)将土壤分离所得的产黄青霉菌悬液接种于PASM，置于培养箱培养；3)将2)中培养完成的PASM制成产黄青霉菌孢子溶液，加入PAB后用纳秒脉冲功率技术刺激处理；4)将步骤1)中制备得到的PAW，基于剂量自动控制方法通过点滴方式加入到含有经过步骤3)处理过的产黄青霉菌孢子溶液的培养基中进行发酵，使得青霉素产量得到提高。本发明专利技术采用等离子体技术和纳秒脉冲电场技术干预产黄青霉，有效上调pcbAB，pcbC和penDE的表达，同时显著缩短产黄青霉的生长周期，大幅度提高青霉素产量。大幅度提高青霉素产量。大幅度提高青霉素产量。

【技术实现步骤摘要】
一种提高青霉素产量的物理刺激方法


[0001]本专利技术涉及一种提高青霉素产量的方法，属于生物


技术介绍

[0002]青霉素是由一种产黄青霉产生的一类天然的抗生素，具有抗菌谱广、疗效高、毒性低的特点，被收录于世界卫生组织基本药物标准清单中，是目前人类最有效和最安全的基本健康药物之一。目前，关于提高青霉素发酵产量及缩短发酵周期的主要技术手段包括：诱变选育高产菌株；基因工程定向获取高产菌株；优化菌株发酵环境条件，提高菌株发酵产量。然而，现有的技术手段在实际应用中都存在着不少固有缺点。诱变选育的问题在于遗传负荷过重以及菌株的耐药性提高所引起的正向突变骤减甚至消失，从而导致难以选育出新的高产菌株。基因工程的问题在于严重依赖于有效的基因靶点，由于基因靶点数量的限制使得构建成熟稳定的工程菌愈发困难。菌株发酵环境条件优化的问题在于优化上限的存在，对于某一确切的菌株而言，当外界因素达到最优组合时将无法再继续优化以进一步提高发酵产量、缩短发酵周期。对于已经经过长时间增产研究的产黄青霉而言，上述问题格外突出，已经成为制约青霉素工业发展的一个重大瓶颈问题。
[0003]纳秒脉冲电场(nsPEF)技术作为脉冲功率技术的延伸和发展，具有高场强(kV/cm)、短脉宽(ns)、低热效应(J/cc)、高瞬时功率(mWatts)的特点，能够在极短时间内将电场能量释放到靶细胞，从而触发一系列生物学效应，包括了激活血小板凝集酶，促进血小板快速凝集，从而加速伤口愈合速度；引起DNA损伤、改变线粒体膜电位、激活线粒体凋亡通路，导致细胞凋亡；调节Wnt/β-catenin信号通路，提高原代软骨细胞的增殖速率。更为重要的是，纳秒脉冲电场还能够调控细胞内钙离子浓度，进而影响细胞生长与代谢活动。
[0004]等离子体活化水(PAW)是等离子体技术的延伸和发展，是通过等离子体装置激发处理溶液后得到的富含各种活性自由基的溶液。由于富含各种自由基，PAW具有出众的氧化杀菌能力，能够有效延长果蔬保存时间，去除果蔬表面残留的农药，在医学和食品领域得到了广泛的应用。最近的研究表明，PAW具有剂量效应，能够促进细胞增殖、调控植物生长，表现为高浓度下的PAW能够灭活细菌病毒，抑制种子萌发、而相对低剂量下的PAW则能够促进酵母细胞的增殖，促进种子萌发。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种提高青霉素产量的物理刺激方法，采用纳秒脉冲功率技术和等离子体技术处理产黄青霉孢子能有效上调与青霉素合成密切相关的基因pcbAB、pcbC和penDE的表达量，促进青霉素的合成；同时，还能够显著缩短青霉素的发酵周期，大幅度提高青霉素的产量。
[0006]本专利技术提供的提高青霉素产量的物理刺激方法，包括如下步骤：1)制备大气压低温等离子体活化水PAW，进一步形成大气压低温等离子体活化固态培养基PASM以及大气压低温等离子体活化微泡PA3；2)将土壤分离所得的产黄青霉菌悬液接种于PASM，置于培养箱
培养；3)将2)中培养完成的PASM制备形成产黄青霉菌孢子溶液，加入PAB后用纳秒脉冲功率技术刺激处理；4)将步骤1)中制备得到的PAW，基于剂量自动控制方法通过点滴方式加入到含有经过步骤3)处理过的产黄青霉菌孢子溶液的培养基中进行发酵，使得青霉素产量得到提高。
[0007]上述的方法中，所述PAW采用大气压低温等离子体装置伸入去离子水中制备得到，工作气源为空气，激发端所处位置在去离子水液面之下，且与液面的距离为10-30mm，具体可为15mm；处理功率为25-40W，具体可为30W；处理时长为5-20min，具体可为10min；处理后稀释100-500倍得到PAW，具体稀释倍数可为400倍。
[0008]所述PASM通过在固态培养基冷凝之前加入PAW制备而成，PAW的添加量为每30mL固态培养基中添加1-3mL的PAW，具体可为2mL。
[0009]上述的方法中，步骤2)中，将从土壤分离所得的0.1-0.3mL产黄青霉菌悬液接种于PASM中，其中产黄青霉菌悬液的接种量具体可为0.2mL，所述的培养周期可为4～8天，具体可为5天，其有益效果是缩短了所需要的培养周期。
[0010]上述的方法中，所述产黄青霉孢子溶液的制备过程为将处于产孢期的长有产黄青霉菌的PASM用PBS缓冲溶液冲洗，过滤掉产黄青霉的菌丝，即得到纯的所述产黄青霉孢子溶液。
[0011]所述PAB通过在制备微泡中加入PAW制备而成，其中PAW的添加量为5-10mL/L，具体可为5mL/L；PAB的微泡粒径在2-100um，具体可为50um。
[0012]上述方法中，步骤3)中，产黄青霉菌孢子溶液加入PAB后用纳秒脉冲功率技术刺激处理，其中，PAB的添加量为0.1-0.3mL/L，具体可为0.25mL/L；纳秒脉冲功率技术的脉冲宽度可为30～150ns，具体可为100ns；电场强度可为6～15kV/cm，具体可为8kV/cm；脉冲频率可为0.5～5Hz，具体可为1Hz，脉冲个数为8～30个，具体可为25个。
[0013]上述方法中，步骤4)中，所述PAW的剂量自动控制方法，每隔1-4小时检测培养基中NO或H2O2的浓度，具体可为3小时；当NO或H2O2的浓度低于设定值时，按照每小时5-20mL的点滴速率向培养基中添加PAW，具体可为10mL/h；NO浓度的设定值为100-300nM，具体可为200nM，H2O2浓度的设定值为0.3-3mM，具体可为1mM。
[0014]本专利技术具有以下优点：
[0015]1)利用PAW制备形成的PASM用于前期菌株的培养，能够极大缩短产黄青霉菌孢子溶液的制备时间与青霉素的发酵周期；
[0016]2)利用PAB和纳秒脉冲功率技术，结合PAW的剂量自动控制方法，能够显著上调与青霉素合成密切相关的基因pcbAB、pcbC和penDE的表达，促进青霉素的合成积累，大幅度提高青霉素产量。
[0017]3)所采用的物理刺激方法，能耗低，操作简便，有效降低生产成本。
附图说明
[0018]图1为本专利技术实施例中采用的实验流程图。
[0019]图2为本专利技术实施例中所使用的装置图，其中图2(a)为等离子体发生器装置图，图2(b)为纳秒脉冲发生器装置图。
[0020]图3为本专利技术实施例中产黄青霉在PASM上的生长情况。
[0021]图4为本专利技术实施例中对青霉素产量的检测。
[0022]图5为本专利技术实施例中实时定量RT-PCR技术检测物理方法刺激产黄青霉后的关键基因表达变化情况。
具体实施方式
[0023]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]下述实施例中，PBS缓冲溶液由NaCl(8g/L)、KCl(0.2g/L)、Na2HPO4(1.44g/L)和KH2PO4(0.24g/L)组成，PH为7.4。
[0026]实施例1、提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高青霉素产量的物理刺激方法，由如下步骤组成：1)制备大气压低温等离子体活化水PAW，进一步形成大气压低温等离子体活化固态培养基PASM以及大气压低温等离子体活化微泡PAB；2)将土壤分离所得的产黄青霉菌悬液接种于PASM，置于培养箱培养；3)将2)中培养完成的PASM制备形成产黄青霉菌孢子溶液，加入PAB后用纳秒脉冲功率技术刺激处理，所述PAB的添加量为0.1-0.3mL/L；纳秒脉冲功率技术的脉冲宽度为30-150ns，电场强度为6-15kV/cm，脉冲重复频率为0.5～5Hz，脉冲个数为8～30个；4)将步骤1)中制备得到的PAW，基于剂量自动控制方法通过点滴方式加入到含有经过步骤3)处理过的产黄青霉菌孢子溶液的培养基中进行发酵，使得青霉素产量得到提高。2.根据权利要求1所述的大气压低温等离子体活化水PAW，其特征在于，所述PAW采用大气压低温等离子体装置伸入去离子水中制备得到；其中，大气压低温等离子体的电子密度大于10
15
/cm3，臭氧浓度小于0.001ppm...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴松杰，郑永平，董飞宏，张珏，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：