一种探针组、传感器、检测方法及其用途技术

本发明专利技术涉及生化分析检测领域，具体涉及一种探针组、传感器、检测方法及用途，本发明专利技术提供的一种探针组，包括发夹探针HP1，发夹探针HP2，发夹探针HP3；上述发夹探针在T7核酸外切酶的辅助下可以实现三重循环扩增策略检测靶标黄曲霉毒素B1，检测灵敏度高，无需荧光标记，成本低，在最佳条件下，检测限低至0.19pg/mL，检测线性范围宽，特异性高，能够区分黄曲霉毒素B1和其他黄曲霉毒素。本发明专利技术应用于中药材和食品样品中黄曲霉毒素B1的微量检测，效果良好，在食品药品安全领域具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种探针组、传感器、检测方法及其用途
本专利技术涉及生化分析检测领域，具体涉及一种探针组、传感器、检测方法及用途。
技术介绍
黄曲霉毒素是由黄曲霉、寄生曲霉和特异曲霉等多种真菌产生的代谢产物，是一类化学结构类似的天然真菌毒素。常见于花生、玉米、大豆、小麦等粮食作物，具有很强的致癌、致畸和致突变性。目前已分离鉴定出近20种黄曲霉毒素，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2，其中，黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性和致癌性最强。短期内大量摄入AFB1可导致急性中毒，其急性毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍；慢性毒性可诱发癌变，致癌能力是二甲基亚硝胺的75倍，二甲基偶氨苯的900倍。1993年，AFB1被国际癌症研究机构(IARC)划定为1类致癌物。随着人们对食品安全问题的关注度越来越高，黄曲霉毒素的污染越来越受到世界各国政府的重视。除国际食品法典委员会(CAC)的规定以外，全球100多个国家和地区制定了各类食品中黄曲霉毒素的限量标准。总体上，食品中AFB1的限量范围为1-20μg/kg，黄曲霉毒素总量(B1+B2+G1+G2)的限量范围为0-35μg/kg。美国相关标准规定人类消费食品中的黄曲霉毒素总量不能超过20μg/kg，牛奶中黄曲霉毒素M1的含量不能超过0.5μg/kg。欧盟规定更加严格，要求人类生活消费品中AFB1的含量不能超过2μg/kg，黄曲霉毒素总量不能超过4μg/kg。因此，开发快速、低成本、高灵敏检测AFB1的新方法具有重要的意义。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种探针组、传感器、检测方法及用途，以满足食品安全领域快速、低成本、高灵敏检测AFB1的需要。为此，本专利技术提供了如下的技术方案：本专利技术提供了一种探针组，包括：发夹探针HP1，由5’端到3’端依次包括结合靶标的适体序列和第一结合序列，所述适体序列与所述第一结合序列的部分碱基配对使所述发夹探针HP1形成发夹结构；所述发夹探针HP1的5’端为突出末端；发夹探针HP2，由5’端到3’端依次包括第二结合序列和二级靶标序列TS，所述第二结合序列与所述二级靶标序列TS的部分碱基配对使所述发夹探针HP2形成发夹结构；所述第二结合序列为所述第一结合序列的互补序列；所述发夹探针HP2的5’端为突出末端；发夹探针HP3，由5’端到3’端依次包括第三结合序列和三级靶标序列TT，所述第三结合序列与所述三级靶标序列TT的部分碱基配对使所述发夹探针HP3形成发夹结构；所述第三结合序列可以与所述二级靶标序列TS部分互补杂交，并在二级靶标序列TS的3’端形成平末端；所述发夹探针HP3的5’端为突出末端；所述二级靶标序列TS和所述三级靶标序列TT包含荧光分子的模板序列。所述的探针组中：所述发夹探针HP1由5’端到3’端依次包括序列a、序列b、序列c、序列d、序列b*；序列a、序列b、序列c为适体序列；序列d、序列b*为第一结合序列；所述发夹探针HP2由5’端到3’端依次包括序列b、序列d*、序列f、序列e、序列d；序列b、序列d*为第二结合序列；序列f、序列e、序列d为二级靶标序列TS；所述发夹探针HP3由5’端到3’端依次包括序列d*、序列e*、序列d*、序列e*、序列g、序列f、序列e、序列d；序列d*、序列e*、序列d*、序列e*为第三结合序列，序列g、序列f、序列e、序列d为三级靶标序列TT。所述的探针组，所述适体序列是以黄曲霉素B1为生物靶标的适体序列，所述二级靶标序列TS和所述三级靶标序列TT包含银纳米簇AgNCs的模板序列。所述的探针组，所述发夹探针HP1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述发夹探针HP2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述发夹探针HP3的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术提供了一种检测体系，其特征在于，包括所述的探针组；优选的，所述检测体系中，所述发夹探针HP1、发夹探针HP2和发夹探针HP3的摩尔比为1:1:(1-3)。本专利技术提供了一种传感器，包括所述的探针组或所述的检测体系。所述的传感器，以总体积为100μL为计，包括：第一反应液，包括：发夹探针HP1，浓度为0.8-1.2μmol/L，3μL；发夹探针HP2，浓度为0.8-1.2μmol/L，3μL；发夹探针HP3，浓度为0.8-1.2μmol/L，6μL；T7核酸外切酶，浓度为8-12U/μL，2μL；第一反应缓冲液，36μL；可选的，还包括第二反应液，包括：第二反应缓冲液，48μL；AgNO3溶液，浓度为50-70μmol/L，1μL；NaBH4溶液，浓度为50-70μmol/L，1μL。本专利技术提供了一种生物靶标的检测方法，包括使用所述的探针组、所述的检测体系，或所述的传感器；优选地，所述生物靶标为黄曲霉毒素B1。所述的检测方法，包括如下步骤：S1，将待测样品、发夹探针HP1、发夹探针HP2、发夹探针HP3和T7核酸外切酶在第一反应缓冲液中混合，混合液加热孵育，然后冷却至室温，得第一反应液；S2，取第一反应液加入第二反应缓冲液中，然后向所述第二反应缓冲液中加入AgNO3溶液，振荡后室温下避光孵育，然后加入还原溶液，室温下避光孵育，得第二反应液；S3，对所述第二反应液进行荧光测定，实现对所述生物靶标的检测；优选地，所述步骤S1中，混合液加热孵育的条件为35-40℃孵育100-140分钟；优选地，所述第一缓冲液为NEBuffer4缓冲液，所述第二缓冲液为柠檬酸钠缓冲液，所述还原溶液为NaBH4溶液；优选地，所述NEBuffer4缓冲液包含20mMTris-HNO3,50mMKNO3,10mMMg(NO3)2,所述NEBuffer4缓冲液的pH7.9；优选地，所述柠檬酸钠缓冲液包含10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05％Tween20,所述柠檬酸钠缓冲液的pH7.0。所述的探针组、所述的检测体系，或所述的传感器在如下a1-a2至少一种中的用途：a1，检测生物靶标；a2，制备检测生物靶标的产品；可选的，所述生物靶标为黄曲霉毒素B1。可选的，在检测中药材或粮食中的黄曲霉毒素B1的应用。本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的探针组，包括：发夹探针HP1，由5’端到3’端依次包括结合靶标的适体序列和第一结合序列，所述适体序列与所述第一结合序列的部分碱基配对使所述发夹探针HP1形成发夹结构；所述发夹探针HP1的5’端为突出末端；发夹探针HP2，由5’端到3’端依次包括第二结合序列和二级靶标序列TS，所述第二结合序列与所述二级靶标序列TS的部分碱基配对使所述发夹探针HP2形成发夹结构；所述第二结合序列为所述第一结合序列的互补序列；所述发夹探针HP2的5’端为突出末端；发夹探针HP3，由5’端到3’端依次包括第三结合序列和三级靶标序列TT，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.探针组，其特征在于，包括：/n发夹探针HP1，由5’端到3’端依次包括结合靶标的适体序列和第一结合序列，所述适体序列与所述第一结合序列的部分碱基配对使所述发夹探针HP1形成发夹结构；所述发夹探针HP1的5’端为突出末端；/n发夹探针HP2，由5’端到3’端依次包括第二结合序列和二级靶标序列TS，所述第二结合序列与所述二级靶标序列TS的部分碱基配对使所述发夹探针HP2形成发夹结构；所述第二结合序列为所述第一结合序列的互补序列；所述发夹探针HP2的5’端为突出末端；/n发夹探针HP3，由5’端到3’端依次包括第三结合序列和三级靶标序列TT，所述第三结合序列与所述三级靶标序列TT的部分碱基配对使所述发夹探针HP3形成发夹结构；所述第三结合序列可以与所述二级靶标序列TS部分互补杂交，并在二级靶标序列TS的3’端形成平末端；所述发夹探针HP3的5’端为突出末端；/n所述二级靶标序列TS和所述三级靶标序列TT包含荧光分子的模板序列。/n

【技术特征摘要】
1.探针组，其特征在于，包括：
发夹探针HP1，由5’端到3’端依次包括结合靶标的适体序列和第一结合序列，所述适体序列与所述第一结合序列的部分碱基配对使所述发夹探针HP1形成发夹结构；所述发夹探针HP1的5’端为突出末端；
发夹探针HP2，由5’端到3’端依次包括第二结合序列和二级靶标序列TS，所述第二结合序列与所述二级靶标序列TS的部分碱基配对使所述发夹探针HP2形成发夹结构；所述第二结合序列为所述第一结合序列的互补序列；所述发夹探针HP2的5’端为突出末端；
发夹探针HP3，由5’端到3’端依次包括第三结合序列和三级靶标序列TT，所述第三结合序列与所述三级靶标序列TT的部分碱基配对使所述发夹探针HP3形成发夹结构；所述第三结合序列可以与所述二级靶标序列TS部分互补杂交，并在二级靶标序列TS的3’端形成平末端；所述发夹探针HP3的5’端为突出末端；
所述二级靶标序列TS和所述三级靶标序列TT包含荧光分子的模板序列。


2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，
所述发夹探针HP1由5’端到3’端依次包括序列a、序列b、序列c、序列d、序列b*；序列a、序列b、序列c为适体序列；序列d、序列b*为第一结合序列；
所述发夹探针HP2由5’端到3’端依次包括序列b、序列d*、序列f、序列e、序列d；序列b、序列d*为第二结合序列；序列f、序列e、序列d为二级靶标序列TS；
所述发夹探针HP3由5’端到3’端依次包括序列d*、序列e*、序列d*、序列e*、序列g、序列f、序列e、序列d；序列d*、序列e*、序列d*、序列e*为第三结合序列，序列g、序列f、序列e、序列d为三级靶标序列TT。


3.根据权利要求1或2所述的探针组，其特征在于，所述适体序列是以黄曲霉素B1为生物靶标的适体序列，所述二级靶标序列TS和所述三级靶标序列TT包含银纳米簇AgNCs的模板序列。


4.根据权利要求1或2所述的探针组，其特征在于，所述发夹探针HP1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述发夹探针HP2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述发夹探针HP3的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


5.一种检测体系，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的探针组；
优选的，所述检测体系中，所述发夹探针HP1、发夹探针HP2和发夹探针HP3的摩尔比为1:1:(1-3)。


6.一种传感器，其特征在于，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴昊，邹霈，刘娅灵，王洪勇，吴军，韩国庆，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32