一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆及其制备方法与应用，属于病毒技术领域。本发明专利技术所用拯救系统在A型塞内卡病毒5’端上游引入CMV增强子、β‑actin启动子和核酶序列；在3’端下游引入核酶和终止子序列，通过RT‑RCR方法分段扩增SVA全长基因组片段，利用同源重组技术克隆至pOK12载体，构建含SVA/HeB全长cDNA的重组质粒。基于感染性cDNA克隆拯救得到的病毒为深入研究SVA的生物学特性、复制机制、致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础，具有重要的科学应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆及其制备方法与应用
本专利技术属于病毒
，尤其涉及一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆及其制备方法与应用。
技术介绍
A型塞内卡病毒(SenecavirusA，SVA)属于小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属成员，为无囊膜的单股正链RNA病毒。现已证实SVA感染猪能够引发原发性水泡病，引起猪的鼻吻、蹄部冠状带的水泡病变，同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等临床表现。与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎引起的临床症状难以区分。2002年，美国科学家首次在细胞培养物中发现SVA。2015年以后，在加拿大、美国、巴西、泰国、中国等多个国家爆发了SVA疫情。通过回顾性监测和流行病学调查发现，SVA在我国多个地区流行和传播，并且流行范围越来越广。但是到目前为止对SVA的致病机制以及相关疫苗的研究甚少，而SVA反向遗传操作平台是研究SVA致病机制以及相关疫苗的关键工具。SVA感染性克隆的构建大多基于传统的酶切将片段与载体连接，其主要包括两种方法：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。而同源重组技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶，并且克隆效率高，阳性克隆高达90％以上。另外全长的cDNA合成以后可以利用两种方法来构建能够产生子代病毒的策略：RNA转染和DNA转染。在RNA转染策略中，病毒的RNA是在体外转录合成的，其使用的是T7或者SP6原核启动子，体外转录出病毒的RNA，然后转染到细胞中启动病毒的拯救过程，但此方法操作繁琐、不稳定且试剂昂贵。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆及其制备方法与应用。本专利技术使用的DNA转染策略，首次采用真核双启动子CMV增强子和β－acitn启动子作为全长病毒基因组cDNA感染性克隆的上游，将完整的质粒直接转染细胞便可以得到感染性的病毒粒子，与其他专利中感染性克隆所使用的启动子相比，本专利技术所采用的构建策略具有更高的启动效率，拯救更快速便捷。为达上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆，其拯救系统是在塞内卡病毒核酸序列的5’端上游插入CMV增强子、β-actin启动子和核酶序列；在塞内卡病毒核酸序列的3’端下游插入核酶和终止子序列。本专利技术所用重组质粒的骨架载体为改造后的pOK-CMV-Actin。在本专利技术中，将所述塞内卡病毒的核苷酸序列通过EcoRI酶切位点以同源重组方式插入pOK-CMV-Actin载体中。所述插入的塞内卡病毒的核苷酸序列如SEQIDNO.7示。本专利技术在SVA全长cDNA基因组的5'端引入锤头状核酶序列(HamRz)，该酶核心序列有58nt，其3'末端C处具有自我剪切修饰位点；在SVA全长cDNA基因组的3'端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRz)，该酶核心序列有88nt，其5'末端G处具有自我剪切修饰位点。当将含有SVA基因组的感染性克隆转染至易感细胞中，通过CMV增强子和β-actin启动子调控元件转录包装出病毒RNA前体，再经锤头状核酶和丁型肝炎病毒核酶的剪切修饰，即可产生具有感染性的病毒RNA。一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：1)载体的改造：选用低拷贝载体pOK12作为A型塞内卡全长感染性cDNA克隆构建的载体，人工合成CMV增强子和β-actin启动子序列，通过SalI和HindIII将其该序列克隆至pOK12载体的相应酶切位点中，构建含双启动子的低拷贝质粒pOK-CMV-Actin。所述人工合成CMV增强子和β-actin启动子核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。2)以A型塞内卡病毒SVA/HeB的cDNA为模板，分别设计、合成覆盖SVA/HeB病毒全基因组的三对重叠引物AF/AR、BF/BR和CF/CR。所述AF的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述AR的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述BF的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述BR的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述CF的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述CR的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；3)将pOK-CMV-Actin利用EcoRI线性化，将线性化片段与SVA基因组的A、B和C片段通过NEB-uilderHiFiDNAAssemblyCloningKit克隆至pOK-CMV-Actin载体，转化到DH5α感受态细胞，获得重组质粒pOK-rSVA/HeB。本专利技术选用低拷贝载体pOK12作为A型塞内卡全长感染性cDNA克隆构建的载体，通过SalI和HindIII将人工合成CMV增强子和β-actin启动子序列克隆至pOK12载体的相应酶切位点中，构建含双启动子的低拷贝质粒pOK-CMV-Actin。本专利技术以SVA/HeB的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVA/HeB株的A基因；所述特异性引物对包括上游引物SVA-AF和下游引物SVA-AR，本专利技术扩增A基因用的引物序列如下所示:SVA-AF:5’-CATCATTTTGGCAAAGTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCTTGAAATGGGGGGCTGGGCCCTCAT-3’(SEQIDNO.1)；SVA-AR:5’-AGGTCCAACTAGAGTTCAAGCCTATG-3’(SEQIDNO.2)；本专利技术在A基因扩增过程中的程序，优选为98℃预变性30s；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。本专利技术扩增A基因所用上游引物SVA-AF引入pOK-CMV-Actin载体EcoRI酶切位点同源臂和锤头状核酶序列，以保证在转录后经剪切修饰产生具有感染性的病毒RNA。本专利技术以SVA/HeB株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增SVA/HeB株的B基因，所述特异性引物对包括上游引物SVA-BF和下游引物SVA-BR，所述上游引物SVA-BF的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述下游引物SVA-BR的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术扩增B基因所用的引物序列如下所示：SVA-BF:5’-CACAACCACAGACCCTTTCTGAA-3’(SEQIDNO.3)；SVA-BR:5’-TGCATTTCCATAAGAGAGAGCGCTC-3’(SEQIDNO.4)；本专利技术在B基因扩增过程中的程序，优选为98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆的制备用引物，其特征在于，所述引物序列如下：/nSEQ ID NO.1：/n5’-CATCATTTTGGCAAAGTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCTTGAAATGGGGGGCTGGGCCCTCAT-3’；/nSEQ ID NO.2：/n5’-AGGTCCAACTAGAGTTCAAGCCTATG-3’；/nSEQ ID NO.3：/n5’-CACAACCACAGACCCTTTCTGAA-3’；/nSEQ ID NO.4：/n5’-TGCATTTCCATAAGAGAGAGCGCTC-3’；/nSEQ ID NO.5：/n5’-TAGGAGCGAGAATGCTTATGACGGC-3’；/nSEQ ID NO.6：/n5’-TACCAGATCTGAATCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCC TTTTCCCTTTTCTGTTCCGAC-3’。/n...

【技术特征摘要】
1.一种A型塞内卡病毒SVA/HeB全长感染性cDNA克隆的制备用引物，其特征在于，所述引物序列如下：
SEQIDNO.1：
5’-CATCATTTTGGCAAAGTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCTTGAAATGGGGGGCTGGGCCCTCAT-3’；
SEQIDNO.2：
5’-AGGTCCAACTAGAGTTCAAGCCTATG-3’；
SEQIDNO.3：
5’-CACAACCACAGACCCTTTCTGAA-3’；
SEQIDNO.4：
5’-TGCATTTCCATAAGAGAGAGCGCTC-3’；
SEQIDNO.5：
5’-TAGGAGCGAGAATGCTTATGACGGC-3’；
SEQIDNO.6：
5’-TACCAGATCTGAATCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCTTTTCCCTTTTCTGTTCCGAC-3’。


2.一种针对A型塞内卡病毒SVA/HeB的单质粒拯救系统，其特征在于，所述单质粒拯救系统为包含有A型塞内卡病毒SVA/HeB核酸序列的真核转录质粒，所述真核转录质粒在塞内卡病毒核酸序列的5’端上游插入CMV增强子、β-actin启动子和核酶序列；在塞内卡病毒核酸序列的3’端下游插入核酶和终止子序列。


3.根据权利要求2所述的单质粒拯救系统，其特征在于，所述单质粒拯救系统所用质粒为pOK12。


4.根据权利要求2所述的单质粒拯救系统，其特征在于，所述单质粒拯救系统塞内卡病毒核酸序列中还包括MluI酶切位点，以其作为遗传标记区别于亲本病毒。


5.一种A型塞内卡病毒SV...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁万哲，郭笑然，赵款，雷白时，张武超，刘小娜，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13