建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法及BMSCs外泌体的应用技术

本发明专利技术涉及一种建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，将腹膜炎患者透析后的腹透流出液注射到小鼠腹腔内。进一步以所建立的小鼠腹透腹膜损伤模型为基础，不断研究可治疗腹透相关性腹膜损伤的治疗方法，最后通过动物实验明确外泌体修复腹透腹膜损伤的作用、摸索最优治疗途径、时机、剂量、频次和疗程，为应用外泌体防治腹透腹膜纤维化奠定坚实理论基础，也为未来解决腹透腹膜纤维化导致过早腹膜失功的重要临床问题提供创新有效安全的方法。

【技术实现步骤摘要】
建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法及BMSCs外泌体的应用
本专利技术属于生物医药
，涉及建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法及BMSCs外泌体的应用。
技术介绍
腹膜透析(PeritonealDialysis，PD)是目前终末期肾病患者广泛采用的重要肾脏替代治疗方式之一，是利用腹膜半透膜生物学特性进行溶质、毒素和水分清除的治疗模式。腹膜透析具有对血流动力学影响小、保护残余肾功能、操作简单、价格相对低廉、保持更好的生活质量等独特优势。随着腹膜透析技术的推广，我国腹膜透析人数和规模呈不断上升的趋势。然而，多数腹透患者往往由于腹透相关性腹膜炎、长期腹透流出液高糖暴露等原因而发生腹膜结构和功能损伤，最终导致腹膜纤维化、超滤衰竭而不得不提前终止腹透治疗。腹膜纤维化发展的主要危险因素是腹膜反复暴露于生物不相容性的腹膜透析液(葡萄糖、葡萄糖降解产物(乙二醛、甲醛、3-脱氧葡糖酮、甲基乙二醛))引起的腹膜间皮细胞功能改变及增殖，以及感染或腹透流出液长期刺激下导致的以免疫细胞浸润为特征的急慢性炎症，二者往往相互促进导致腹膜结构功能进一步损伤。目前，预防或延缓腹透相关性腹膜纤维化尚无有效方法。因此，研发腹透相关性腹膜损伤修复方法和治疗药物显得至关重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，还提供一种BMSCs外泌体在制备腹透腹膜损伤疾病的药物中的新应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.一种建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，所述方法的具体步骤为：将人腹膜炎腹透流出液注射到小鼠腹腔内。进一步，所述腹透流出液为腹膜炎患者透析后的液体经离心、细菌过滤得到的。进一步，腹膜炎患者腹透流出液的纳入标准为：a.首次入院夜间留腹；b.未使用抗生素；c.腹水培养革兰氏阴性杆菌；d.腹水检测白介素-6>5000pg/ml，降钙素原>0.3ng/ml、内毒素>0.1EU/mL。进一步，腹腔注射人腹膜炎腹透流出液0.1mL/g，每日1次，持续4-6周。2.BMSCs外泌体在制备腹透腹膜损伤疾病的药物中的应用。进一步，所述BMSCs外泌体来源于BMSCs细胞培养上清液。进一步，所述BMSCs外泌体的制备方法为：取BMSCs细胞培养上清液，2000-3000g4℃离心30min，取上清；上清经0.22μm滤膜过滤，滤液经100,000-120,000g4℃超速离心1.5-2h；用相同体积的预冷PBS重悬沉淀，悬液经4℃100,000-120,000g离心1.5-2h；沉淀再用预冷PBS重悬即可。进一步，所述BMSCs外泌体的制备方法为：取BMSCs细胞培养上清液，2000g4℃离心30min，取上清；上清经0.22μm滤膜过滤，滤液经120,000g4℃超速离心2h；用相同体积的预冷PBS重悬沉淀，悬液经4℃120,000g离心2h；沉淀再用预冷PBS重悬即可。进一步，所述BMSCs外泌体的应用方法为腹腔注射。进一步，BMSCs外泌体腹腔注射量为按体重计100μg/kg/次。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次通过将腹膜炎患者腹透流出液注射到小鼠腹腔建立起小鼠腹透相关性腹膜损伤模型的方法，为临床研究腹膜透析相关性腹膜损伤相关内容奠定基础。进一步以所建立的小鼠腹透腹膜损伤模型为基础，不断研究可治疗腹膜透析腹膜损伤的方法，最后通过动物实验明确外泌体修复腹透腹膜损伤的作用、摸索最优治疗途径、时机、剂量、频次和疗程，为应用外泌体防治腹透腹膜纤维化奠定坚实理论基础，也为未来解决腹透腹膜纤维化导致过早腹膜失功的重要临床问题提供创新有效安全的方法。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为通过流式细胞术检测BMSCs表面标志(CD29、CD44、CD34、CD11b)的结果，其中A为CD29，B为CD44，C为CD11b，D为CD34的流式检测结果。图2为BMSCs形态及BMSCs成脂、成骨、成软骨三种诱导分化的鉴定结果，其中A为倒置显微镜下观察BMSCs形态；B为小鼠BMSCs成脂诱导油红O染色；C为小鼠BMSCs成骨诱导茜素红染色；D为小鼠BMSCs成软骨诱导阿利辛蓝染色，×200倍。图3为BMSCs外泌体的鉴定结果，其中A为透射电镜下观察外泌体形态，B、C、D依次为WB检测外泌体标志蛋白：CD9(22KD)、CD63(26KD)和TSG101(44KD)。图4为人腹膜炎腹透流出液诱导小鼠腹透腹膜损伤模型的建立及外泌体干预方法的实验流程图。图5为BMSCs外泌体抑制腹透腹膜损伤小鼠的腹膜纤维化结果。其中A为不同组小鼠腹膜组织的Masson染色，B、C、D依次为α-SMA、Collagen-I、Collagen-III免疫组化染色，字母后面的数字分别指代对应的实验组数，后同。图6为各实验组数据分析柱形图，其中A为不同组小鼠腹膜厚度比较；B为不同组小鼠腹膜组织免疫组化α-SMA阳性面积百分比；C为不同组小鼠腹膜组织免疫组化Collagen-I阳性面积百分比；D为不同组小鼠腹膜组织免疫组化Collagen-III阳性面积百分比。图7为不同组小鼠腹膜组织中α-SMA(A)、Collagen-I(B)、Collagen-III(C)、TGF-β1(D)的qRT-PCR数据分析柱形图(*P<0.05或**P<0.01或***P<0.001)。图8为不同组小鼠腹膜组织的免疫组化染色图和不同组小鼠腹膜组织免疫组化阳性细胞率数据分析图，其中A、B、C组图片依次为CD68、F4/80、MPO染色结果；D、E、F依次为不同组小鼠腹膜组织免疫组化CD68、F4/80、MPO阳性细胞率。图9为不同组小鼠腹膜组织中IL-1β(A)，IL-6(B)，TNF-α(C)的qRT-PCR分析(*P<0.05或**P<0.01或***P<0.001)，×200。图10为不同组小鼠腹膜组织的免疫组化染色(CA125)和免疫荧光染色(E-Cadherin、Ki-67共染)结果。其中A为不同组小鼠腹膜组织CA125的免疫组化染色，×200。B-D为不同组小鼠腹膜组织的免疫荧光染色(E-Cadherin、Ki-67共染)，×600。图11为不同组小鼠腹膜组织GS1-lectin、VEGF表达免疫组化结果，其中A、B依次为不同组小鼠腹膜组织GS1-lectin、VEGF表达的免疫组化染色，C为不同组小鼠腹膜组织免疫组化GS1-lectin阳性面积百分比；D为不同组小鼠腹膜组织免疫组化VEGF阳性面积百分比；E为不同组小鼠腹膜组织中VEGF的qRT-PCR分析(*P<0.05或**P<0.01或***P<0.001)，×200。图12为BMSCs外泌体保护腹透腹膜损伤小鼠的腹膜超滤功能实验结果，其中A为不同组小鼠腹膜组织AQP-1的免疫组化染色，×200。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：将腹膜炎患者透析后的腹透流出液注射到小鼠腹腔内。/n

【技术特征摘要】
1.建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：将腹膜炎患者透析后的腹透流出液注射到小鼠腹腔内。


2.根据权利要求1所述建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，其特征在于，所述腹透流出液为腹膜炎患者透析后的液体经离心、细菌过滤得到的。


3.根据权利要求1或2所述建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，其特征在于，腹膜炎患者腹透流出液的纳入标准为：
a.首次入院夜间留腹；b.未使用抗生素；c.腹水培养革兰氏阴性杆菌；d.腹水检测白介素-6>5000pg/ml，降钙素原>0.3ng/ml、内毒素>0.1EU/mL。


4.根据权利要求1-3任一项所述建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，其特征在于，按小鼠体重计，腹腔注射腹膜炎腹透流出液0.1mL/g，每日1次，持续4-6周。


5.BMSCs外泌体在制备腹透腹膜损伤疾病的药物中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述BMSCs外泌体来源于BMSCs细胞培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：何娅妮，喻芳，陈客宏，陈佳，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军特色医学中心，
类型：发明
国别省市：重庆;50