一种柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法技术

本发明专利技术属于柑橘轮斑病抗性鉴定技术领域，公开了一种柑橘轮斑病抗性的鉴定方法，全面对柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律调查；对万州柑橘轮斑病病原进行分离鉴定；开展柑橘轮斑病扩散流行风险性分析和遗传多样性分析；利用已经分离的菌种进行轮斑病防治药剂的筛选试验；创新建立柑橘轮斑病绿色防控集成技术。初步摸清其发病特点和规律，建立了10度环境下，叶片进行背面针刺10针的室内接种抗性鉴定方法，筛选有效防控药剂，初步建立一套绿色防控技术体系。本发明专利技术能快速鉴定不同柑橘品种对轮斑病的抗性，有效降低发病率，提高产量和效益，降低环境污染；对其他柑橘品种和产区轮斑病防治同样具有参考价值，经济效益、社会效益和生态效益显著。

【技术实现步骤摘要】
一种柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法
本专利技术属于柑橘轮斑病抗性鉴定
，尤其涉及一种柑橘轮斑病室内抗性的鉴定方法。
技术介绍
目前，世界上所有重要的甜橘经济品种都起源于南亚和印度。如今柑橘已经遍布世界各地，只要有充足的降雨量或者灌溉就可以维持柑橘植株生长，即使有冰冻发生，一般也不会严重到使柑橘树死亡。中国是世界柑橘生产大国，以种植宽皮柑橘为主，宽皮柑橘类约占60％，甜橙类占30％，其余为柚子、柠檬和金柑等。据文献记载，甜橘生长期具明显危害的真菌性病害已多达35种。这些已报到的真菌性病害一般都在温暖湿润的季节发生，侵染多种柑橘品种的叶片、枝干和果实。柑橘轮斑病是柑橘产区出现的一种新的真菌性病害，是一种低温性侵染病害，通常在冬末春初爆发侵染，危害柑橘叶片、枝梢、果实。而2006年或更早，陕西省城固县温州蜜柑(CitrusunshiuMarcov.)及金橘(Fortunellamargarita(Lour.)Swingle)上发生一种毁灭性病害，每年冬春季叶片提前脱落，枝干大量枯死，树势衰弱，严重时整株枯死，甚至毁园。该病害已呈现出逐年严重的趋势，极大地影响了当地相橘生产和经济效益。对于该病害的病因，尚未有严密程序的病原鉴定。根据症状，当地有关技术人员将之推断为炭疽病、树脂病、湿腐病、脚腐病等侵染性病害和周期性冻害，以及排水不良引起的湿害等非侵染性病害。尽管采取了一些相关的防治措施，但见效甚微，病害依然肆意，严重威胁其柑橘产业健康发展。后浙江大学李红叶教授团队从城固釆集发病叶片、枝梢和枝干，通过分离培养，子实体的形态学和分子特征研究，以及致病性测定，确定病菌的分类地位，同时对病菌的生物学特性进行了研究。发现，个别症状严重的果园内叶片发病率可达100％。该病害只在晚冬和早春的时候流行。发病初期叶片上出现轮纹状的圆形病斑，具轮纹，将其称之为“轮斑病”(Targetspot)。据文献记载，甜橘生长期具明显危害的真菌性病害已多达35种。这些已报道的真菌性病害一般都在温暖湿润的季节发生，侵染多种柑橘品种的叶片、枝干和果实。与众不同的是，柑橘轮斑病属于低温型病害，在冬末春初发病最重，高温季节一般不发病。其在12月中旬开始出现症状，并逐渐加重，2月下旬至3月中旬为发病高峰，病叶在3月中下旬基本落光。由于它传播快、危害程度严重、危害柑橘品种较多、防治困难，给已发病地区柑橘种植户造成巨大的经济损失，成为一种新的毁灭性病害。2018年以前，在我国仅陕南温州蜜柑种植区发现此病大面积爆发危害，且没发现危害果实。2018年在万州发现该病危害，并首次在万州发现该病也侵染果实，造成果实出现直径0.2cm-2.2cm、黑褐色凹陷斑点，最终提前落果，导致全园失收或毁园。该病除危害温州蜜柑、金柑和尤力克柠檬外，冰糖桔、宽皮柑橘(朱红桔、椪柑、杂柑等)、脐橙、北京柠檬、柚等多个柑橘类型均可发病。对苹果和梨也有潜在的侵染风险。由此，给全国柑橘产业带来巨大威胁。柑橘轮斑病发病初期叶片上出现轮纹状的圆形病斑，叶片病斑上可产生黑色的子实体，将其划定为拟隐壳孢属，病原菌命名为柑橘拟隐球壳孢菌Cryptosporiopsiscitricarpar，后被重新鉴定为一个单型属PseudofabraeaCitricarpar，并建立了分子检测方法。2018年3月，浙江大学李红叶教授，陕南柑橘综合试验站站长丁德宽、奉节柑橘综合试验站站长黄涛江、西南大学植保学院博士后杨宇衡副教授、浙江大学博士肖小娥组成的专家小组，来万现场考察病害田间表现症状，结合室内病原菌鉴定结果，初步确诊为柑橘轮斑病。并对防治给予了一定的措施建议，如可以在雨季之前，先喷洒一次波尔多液，再喷洒一次苯醚甲环唑或咪鲜胺。选择在温暖、干燥的季节修剪枝条。病害严重时，移除和烧毁病枝，并且在伤口处涂漆保护。2018年以前，在我国仅陕南温州蜜柑种植区发现此病大面积爆发危害，且没发现危害果实。2018年在万州发现该病危害，并首次在万州发现该病也侵染果实，造成果实出现直径0.2cm-2.2cm、黑褐色凹陷斑点，最终提前落果，导致全园失收或毁园。据报道，该病除危害温州蜜柑、金柑和尤力克柠檬外，宽皮柑橘(朱红桔、椪柑、杂柑等)、脐橙、北京柠檬、柚等多个柑橘类型均可发病。对苹果和梨也有潜在的侵染风险。由此，给全国柑橘产业带来巨大潜在威胁。柑橘轮斑病发病初期叶片上出现轮纹状的圆形病斑，病斑上可产生黑色的子实体。从受害叶片、嫩梢和枝干上可不断地分离得到拟隐壳孢属的一种真菌。通过在温州蜜柑的叶片上接种该菌的分生孢子悬浮液，完成科赫氏法则。基于构建系统进化树，显示该病原菌属于拟隐壳孢属有性型：明孢盘菌属，皮生科；分别基于LSU、ITS、SSU、TUB基因构建系统进化树，显示分离得到的病原菌菌株单独聚成一个分枝。通过形态学的进一步鉴定，病原菌与拟隐壳孢属已报道的真菌都不尽一致，推测其可能为拟隐壳孢属的一个新种。将其命名为柑橘拟隐球壳孢菌Cryptosporiopsiscitricarpar(LiZhu,etal.,2011)，并对防治给予了一定的建议(朱丽,2012)。之后Yang等人建立了柑橘拟隐球壳孢菌SCAR快速诊断法(YuhengYang,etal.,2018)。柑橘轮斑病作为近几年在柑橘上新出现的一种病害，目前仅在陕西城固和重庆万州有报道，且仅仅针对其危害症状、病菌分离和分子鉴定有极少量的研究，万州的柠檬(Citruslimon(L.)Burm.F.)轮斑病还处于泛滥和无法有效防控的状态，人们对该病菌认识缺乏，危害情况、发病规律均无报道，绿色防控技术更少有研究。由于柑橘轮斑病具有传播途径广、速度快、危害大和防控难等特点，防控不当和不及时，可能导致轮斑病迅速蔓延，对全国柑橘产业都将造成重大影响。因此，急需进行柑橘轮斑病危害情况普查，开展发病规律及绿色防控技术研究和应用。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前对柑橘轮斑病还处于泛滥和无法有效防控的状态，人们对该病菌认识缺乏，危害情况、发病规律、室内抗性鉴定方法等均无报道，绿色防控技术更少有研究。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法。本专利技术是这样实现的，一种柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，所述柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法包括以下步骤：步骤一，全面系统调查全区柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律：轮斑病在万州柠檬上的发病面积9000亩，占柠檬种植面积的十分之一，危害程度重，造成树势衰弱，枯枝落叶，发病区域果实发病率100％。调查柑橘轮斑病发病规律:柑橘轮斑病是柑橘产区出现的一种新的真菌类、低温性病害，危害柑橘叶片、枝梢、果实，一般于12月份开始出现症状，然后逐渐加重，到第二年2月份时达到顶峰，并开始陆续落叶，最后枝干干枯，造成严重落果，甚至整株枯死，给当地果农造成巨大的经济损失。当年新生叶片12月份前一般观察不到任何症状。被调查的不同海拔的果园均有轮斑病发生，包括温州蜜柑、金橘、柠檬、宽皮柑橘(朱红桔、椪柑、杂柑等)、脐橙、柚等多个柑橘类型均可发病。相比较而言，地势较低本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种的柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，其特征在于，所述柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法包括以下步骤：/n步骤一，全面系统调查全区柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律；/n步骤二，对柑橘(柠檬)轮斑病病原进行分离鉴定：观察菌落、分生孢子和分生孢子梗形态，分离菌株多个；在PDA培养基上20℃培养15天后，菌落致密，初期白色至灰色，后逐渐变蓝黑色，气生菌丝丰富，白色棉絮状，培养基背面奶黄色，并伴有黑褐色小点；显微镜分析分生孢子椭圆形、长椭圆形，向一侧略弯，顶端钝圆，基部略呈圆锥状，有明显的油球；培养基上不产生厚垣孢子和刚毛；培养2个月后，培养基表面或底部产生黑色的菌核；/n步骤三，对柑橘轮斑病进行室内抗性鉴定：柠檬叶片背面针刺接种新鲜轮斑病菌丝块，10℃环境下保湿培养12-15天，柠檬叶片可明显发病，建立柑橘轮斑病室内接种方法；/n步骤四，开展柑橘轮斑病遗传多样性分析和扩散流行风险性分析；/n步骤五，进行轮斑病防治药剂的筛选试验：筛选咪鲜胺、多菌灵、苯醚甲环唑；咪鲜胺+矿物油复配，与多菌灵轮换使用，补充硫酸锌；/n步骤六，创新建立柑橘轮斑病绿色防控集成技术；建立10月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+0.3％硫酸锌，11月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+97％矿物油150-200倍液，12月初用25％多菌灵可湿性粉剂500倍+97％矿物油150-200倍液，1月初用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液喷施的用药方案，结合实施冬季清园、清除落果和病残枝、做好果园排水、根系复壮，及时剪除病部，搞好树冠修剪和微生态改良，实施营养诊断配方施肥增强树势，果实及时套袋，建立柑橘(柠檬)轮斑病绿色防控集成技术。/n...

【技术特征摘要】
1.一种的柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，其特征在于，所述柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法包括以下步骤：
步骤一，全面系统调查全区柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律；
步骤二，对柑橘(柠檬)轮斑病病原进行分离鉴定：观察菌落、分生孢子和分生孢子梗形态，分离菌株多个；在PDA培养基上20℃培养15天后，菌落致密，初期白色至灰色，后逐渐变蓝黑色，气生菌丝丰富，白色棉絮状，培养基背面奶黄色，并伴有黑褐色小点；显微镜分析分生孢子椭圆形、长椭圆形，向一侧略弯，顶端钝圆，基部略呈圆锥状，有明显的油球；培养基上不产生厚垣孢子和刚毛；培养2个月后，培养基表面或底部产生黑色的菌核；
步骤三，对柑橘轮斑病进行室内抗性鉴定：柠檬叶片背面针刺接种新鲜轮斑病菌丝块，10℃环境下保湿培养12-15天，柠檬叶片可明显发病，建立柑橘轮斑病室内接种方法；
步骤四，开展柑橘轮斑病遗传多样性分析和扩散流行风险性分析；
步骤五，进行轮斑病防治药剂的筛选试验：筛选咪鲜胺、多菌灵、苯醚甲环唑；咪鲜胺+矿物油复配，与多菌灵轮换使用，补充硫酸锌；
步骤六，创新建立柑橘轮斑病绿色防控集成技术；建立10月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+0.3％硫酸锌，11月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+97％矿物油150-200倍液，12月初用25％多菌灵可湿性粉剂500倍+97％矿物油150-200倍液，1月初用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液喷施的用药方案，结合实施冬季清园、清除落果和病残枝、做好果园排水、根系复壮，及时剪除病部，搞好树冠修剪和微生态改良，实施营养诊断配方施肥增强树势，果实及时套袋，建立柑橘(柠檬)轮斑病绿色防控集成技术。


2.如权利要求1所述的柑橘轮斑病快速抗性的鉴定方法，其特征在于，步骤一中，所述全面系统对柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律进行调查，包括：
对柑橘轮斑病发生情况进行全面调查，初步摸清柑橘轮斑病发生情况和发病规律，包括发病面积、发病品种、发病率，以及发病与海拔、品种和管理的关系；其中，所述病害发生规律的确定，包括：
(1)调查柑橘轮斑病田间为害的时空分布、病状表现和病原越冬越夏病害侵染循环，初步明确田间发病流行规律；
(2)借助田间小气候观测仪，了解气候与病害发生的关系，确定最佳防治时期，指导田间防控。


3.如权利要求1所述的的柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，其特征在于，步骤二中，所述对万州柑橘轮斑病病原进行分离鉴定，包括：
(1)现场考察柠檬轮斑病田间症状，发病初期叶片正面出现针头大小的红褐色小点，后病斑扩大呈圆形、椭圆形，直径1-13毫米，在叶脉处有拖尾，病斑边缘油渍状，发病后期叶片正面病斑中央产生呈轮纹状分布的黑色子实体。病斑散生，有时2-3个病斑可愈合成大斑。枝梢发病初期病斑呈红褐色小点，略微四陷；病斑逐渐扩大成圆形、椭圆形或梭形，褐色，木质部也变褐，后枝条逐渐萎蔫枯死；果实受害后病斑1-22毫米，2-3个病斑可愈合成大斑，病斑深褐色，深度凹陷，病斑不扩展到果肉，病斑中间后期会产生轮纹状排列的黑色子实体；
(2)采集疑似轮斑病的叶片、枝条和果实，进行室内病原菌分离，在PDA培养基上，通过组织培养法培养，用75％酒精消毒1分钟，然后用1％次氯酸钠消毒30秒，用灭菌超纯水冲洗3次，晾干，放入PDA培养基中，20℃培养7-14天即可获得目的菌落；病斑上有明显的子实体，则先用灭菌蒸馏水清洗叶病斑表面，然后用手术刀或针刮取病斑表面的子实体，用灭菌蒸馏水稀释后，用移液枪移至PDA上，20℃培养7-14天，待长出单个菌落后，挑取单个菌落至新鲜PDA培养基纯化培养；经显微镜观察分生孢子及分生孢子梗特点后，初步诊断为柑橘轮斑病，并在PDA斜面培养，保存于4℃备用；
(3)在分子鉴定上，设计特异性引物，建立稳定的分子鉴定技术，可以在室内快速检测柑橘轮斑病。


4.如权利要求1所述的的柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，其特征在于，步骤三中，选取健康、平整的柠檬叶片，灭菌蒸馏水冲洗干净，超净工作台晾干，灭菌棉花蘸取灭菌蒸馏水，保果叶柄保湿，用直径5毫米的打孔器切取新鲜柑橘轮斑病菌落边缘部分，将有菌丝的一面紧贴叶片叶脉中部左右两侧对称位置，接种15片叶30个点，并分别在0℃、5℃、10℃、15℃和20℃的环境下保湿培养，持续观察发病情况。试验设置4个处理；处理1：在叶脉正面两侧，直径5毫米范围内，各用灭菌大头针进行针刺10针，再接种直...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泉，何锦辉，杨宇衡，张文晶，
申请(专利权)人：重庆三峡农业科学院重庆市万州区甘宁蚕种场，
类型：发明
国别省市：重庆;50