用于分泌细胞因子的经修饰的PDC细胞系制造技术

本发明专利技术涉及一种用于分泌细胞因子的经遗传修饰的PDC(浆细胞样树突状细胞)细胞系、及其在免疫疗法中用于增加抗原特异性细胞的扩增的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于分泌细胞因子的经修饰的PDC细胞系
本专利技术涉及一种经遗传修饰以用于分泌细胞因子的浆细胞样树突状细胞(PDC)细胞系、及其在免疫疗法中用于增加抗原特异性细胞的扩增的用途。
技术介绍
寻求促进抗原特异性细胞产生的免疫疗法方法是已知的。专利技术人已经开发了使用浆细胞样树突状细胞(PDC)细胞系(称为“PDC*细胞系(PDC*line)”)来从供体单核细胞(MNC)、特别是外周血单核细胞(PBMC)诱导抗原特异性细胞毒性细胞的方法(WO2009/138489)。这种方法包括在经辐照和负载抗原的“PDC*细胞系”的存在下培养MNC，所述单核细胞与“PDC*细胞系”共享至少一种HLA分子(例如，HLA-A2)。申请人所进行的工作已经显示出这种治疗方法的吸引力及其在诸如黑色素瘤或肺癌等癌症的免疫疗法治疗中的相当大的潜力(Aspord等人,2012，未公开的数据)。诱导抗原特异性细胞扩增的能力是实施这些新治疗方法的决定因素。特别是从申请WO2009/138489中已知，细胞因子的存在对于这种扩增是必需的。所描述的实验方案包括，第一周，在没有细胞因子的情况下共培养经辐照和负载抗原的PDC*细胞系与MNC；然后，第二周，用经辐照的负载抗原的PDC*细胞系和IL-2进行新刺激。细胞因子在各种免疫反应的产生机制中的重要性是本领域技术人员熟知的，特别是对于IL-2和IL15(Waldmann,NatRev2006)。IL-2主要由激活的T细胞产生，而IL-15及其相关受体IL-15Ra(Dubois等人,2002)由单核细胞或髓样树突状细胞(MDC)产生(Jakobisiak等人,2011)。为了在诱导抗肿瘤反应(NK、抗体或抗原特异性T)中增强细胞功能的目的，已经描述了对体外产生的MDC的瞬时或永久修饰以产生IL15(vandenBergh等人,2015，Steel等人(2010)或Zhang等人(2014))。即使MDC和PDC两者都是抗原呈递细胞，它们也是能够诱导不同类型的免疫反应的两种不同的细胞类型，这取决于病原体或抗原的起源和一般的环境背景，由许多特征进行区分：起源、组织定位、Toll样受体表达、细胞因子产生等。这些关于经修饰以表达IL15的MDC的论文都没有提到使用PDC的可能性，甚至没有考虑IL15或甚至IL2对PDC的至少等同的作用。虽然在WO2009/138489中描述的常规激活和扩增方法已经实现了特别高水平的扩增(Aspord等人,2010)，但在抗原特异性细胞扩增水平上改善这种新的治疗方法仍然是有利的。
技术实现思路
因此，本专利技术涉及一种新的经遗传修饰以表达选自白介素15(IL15)和白介素2(IL2)的细胞因子的PDC细胞系。特别地，根据本专利技术的经遗传修饰的PDC细胞负载有呈肽形式的一种或多种抗原。本专利技术还涉及所述新的经遗传修饰的PDC细胞系用于扩增抗原特异性细胞、特别是单核细胞(MNC)、更特别是外周血单核细胞(PBMC)的用途。本专利技术还涉及一种组合产品或试剂盒，其一方面包含根据本专利技术的经遗传修饰的PDC细胞系，并且另一方面包含单核细胞(MNC)，特别是用于在通过免疫疗法治疗疾病中同时使用。本专利技术还涉及一种疫苗组合物，其包含根据本专利技术的经遗传修饰的PDC细胞系和用于其施用的合适的媒介物。附图说明图1描绘了CD34分子在未经转导的PDC*细胞系(左)或用编码Il-2或IL-15的逆转录病毒上清液转导的PDC*细胞系上的表达的测量。图2描绘了用IL2或IL15逆转录病毒上清液转导的PDC*细胞系的IL2或IL15表达。在信使RNA的水平上(A，针对G6PDH归一化)或在经转导的细胞的上清液中(B，以pg/ml计)检测细胞因子。图3描绘了在将PDC细胞系(未经修饰或经IL2或IL15遗传修饰，负载有黑色素A抗原)与来自3个健康供体的单核细胞共培养14天后抗黑色素ACD8+T细胞的扩增。使用HLA-A2/黑色素A多聚体通过流式细胞术检测抗黑色素ACD8+T细胞。在A中，显示了代表性实验；在B中，描绘了3个实验的结果(％CD8+多聚体细胞)。图4描绘了来自14天共培养的CD8+细胞的功能。细胞毒性细胞的功能是通过在用负载有所使用的黑色素A衍生肽的靶细胞系(T2)刺激后检测胞浆内IFNγ来具体化的。在A中，对用不同细胞系获得的所有特异性和非特异性CD8+细胞进行细胞因子胞浆内检测的图示。在B中，用每种细胞系产生的非特异性(多聚体-)和特异性(多聚体+)细胞中IFNγ阳性CD8+细胞的百分比。具体实施方式因此，本专利技术涉及新的经遗传修饰以表达选自IL15和IL2的细胞因子的PDC细胞系。根据本专利技术的可用于进行遗传修饰的PDC细胞系(也称为初始PDC细胞系)是技术人员熟知的，特别是在EP1572989和WO2009/138489中所描述的。特别地，这些是从PDC白血病细胞获得的细胞。可以特别提及以编号2938和3110保藏在CNCM(国家微生物培养物保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes)，巴斯德研究所(InstitutPasteur)，25rueduDocteurRoux，75015巴黎)的GEN2.2和GEN3细胞系以及衍生自PDC白血病细胞的所有细胞系。“衍生自PDC白血病细胞的细胞系”意指在将PDC白血病细胞注射到免疫缺陷小鼠中之后衍生自肿瘤结节的细胞系，将这些结节撕开以获得在促进所述细胞系生长的合成培养基中培养的细胞悬浮液。根据本专利技术，“选自IL15和IL2的细胞因子的表达”意指经遗传修饰的细胞系分泌细胞因子。所述细胞因子的序列是技术人员熟知的。对于IL2，可以特别提及在UniProtKB条目P60568下标识的蛋白质序列和在Ensembl条目ENSG00000109471下标识的编码序列，并且对于IL-15，可以特别提及在UniProtKB条目P40933下标识的蛋白质序列和在Ensembl条目ENSG00000164136下标识的编码序列。具有与上述序列相同活性的这些细胞因子的变体或片段也是本专利技术的一部分。优选地，所述细胞因子是上文标识的人细胞因子。根据本专利技术，“经遗传修饰的PDC细胞系”意指用允许将基因整合到细胞系的基因组中的病毒颗粒转导的任何细胞系，所述病毒可以是腺病毒、慢病毒或逆转录病毒。优选地，使用莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)类型的逆转录病毒。由HEK293T胶囊化细胞系产生的这些逆转录病毒颗粒天然地或在转染后表达逆转录病毒gag/pol和env序列。本领域技术人员将知道如何制备包含一种或多种目的基因的编码序列和调控元件、特别是用于允许在经遗传修饰的哺乳动物细胞中表达细胞因子的序列的病毒颗粒。可以特别提及允许病毒进入细胞的病毒包膜序列，如4070A、MK-G、HA、LCMV、RD114、HIV、VSV、MLV、GALV、BAEV)；允许启动目的基因的转录的启动子序列，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经遗传修饰以表达选自白介素15(IL15)和白介素2(IL2)的细胞因子的PDC细胞系。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181023 FR 18597731.一种经遗传修饰以表达选自白介素15(IL15)和白介素2(IL2)的细胞因子的PDC细胞系。


2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的细胞系，其中所述初始PDC细胞系从白血病浆细胞样树突状细胞获得。


3.根据权利要求1或2中任一项所述的经遗传修饰的细胞系，其中所述修饰借助于病毒颗粒来进行。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的经遗传修饰的细胞系，其中仅表达所述细胞因子。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的经遗传修饰的细胞系，其中所述细胞系负载有一种或多种抗原。


6.根据权利要求1至4中任一项所述的经遗传修饰的细胞系，其中所述细胞系也经遗传修饰以表达一种或多种抗原。


7.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·汉纳尼，J·普卢马斯，
申请(专利权)人：PDC细胞系制药，法国血液机构，
类型：发明
国别省市：法国;FR