重组病毒载体和用于产生所述重组病毒载体的核酸制造技术

本文描述了用于产生重组腺相关病毒(rAAV)载体的核酸、AAV转移盒和质粒。所公开的核酸、盒和质粒包含表达一种或多种转基因的序列，所述一种或多种转基因在一种或多种疾病或病症的改善、治疗和/或预防中具有治疗功效。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组病毒载体和用于产生所述重组病毒载体的核酸相关申请的交叉引用本申请要求2018年11月21日提交的美国临时申请序列号62/770,202的优先权，所述临时申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
本公开涉及分子生物学和基因疗法的领域。更具体地，本公开涉及用于产生重组病毒载体的组合物和方法。以电子方式提交的文本文件的描述随此以电子方式提交的文本文件的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名称：STRD-011-01WO_Sequence_Listing.txt，记录日期2019年11月21日；文件大小约145千字节)。
技术介绍
重组病毒载体，包括腺相关病毒载体(AAV)，可用作基因递送剂，并且是人类基因疗法的有力工具。使用AAV，可在体内和体外的各种细胞中实现高频稳定的DNA整合和表达。与一些其他病毒载体系统不同，AAV不需要活跃的细胞分裂来稳定整合到靶细胞中。可使用病毒生产细胞系在培养物中产生重组AAV载体。重组AAV的产生通常需要细胞中三种元件的存在：1)包含转基因的核酸，所述转基因侧接AAV反向末端重复(ITR)序列，2)AAVrep和cap基因，以及3)辅助病毒蛋白序列。这三种元件可提供在一个或多个质粒上，并且转染或转导到细胞中。重组AAV载体的产生和使用一直受到不能将转基因DNA有效包装到病毒衣壳中并在靶细胞中有效表达转基因的限制。因此，本领域中需要用于产生重组AAV载体的改进的组合物和方法。
技术实现思路
本文描述了包含AAV转移盒的核酸。所公开的核酸可用于产生重组腺相关病毒(AAV)载体。所公开的核酸和转移盒包含在一种或多种疾病或病症的改善、治疗和/或预防中具有治疗功效的一种或多种转基因的序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种核酸，所述核酸从5′至3′包含5′反向末端重复序列(ITR)、启动子、转基因序列、聚腺苷酸化信号和3′ITR。在一些实施方案中，所述转基因序列编码弗氏共济失调蛋白(FXN)蛋白。所述FXN蛋白可以是例如人FXN蛋白。在一些实施方案中，所述FXN蛋白具有SEQIDNO：65的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述核酸包含SEQIDNO：28-64中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述5′ITR与所述3′ITR的长度相同。在一些实施方案中，所述5′ITR和所述3′ITR具有不同的长度。在一些实施方案中，所述5′ITR和所述3′ITR中的至少一者的长度是约110至约160个核苷酸。所述5’ITR和所述3’ITR中的至少一者可分离自或源自例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽AAV或牛AAV的基因组。在一些实施方案中，所述5’ITR包含SEQIDNO：1的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述3’ITR包含SEQIDNO：2的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述3’ITR包含SEQIDNO：3的序列，或与其至少95％同一的序列。所述启动子可驱动转基因的表达。在一些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述启动子是野生型启动子的经修饰形式。例如，由于AAV的包装限制，启动子的长度可减小。在一些实施方案中，所述启动子是野生型启动子的截短形式。所述启动子可以是例如CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、多角体蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、EF-1α启动子、EF-1α短启动子、EF-1α核心启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、GUSB240启动子、GUSB379启动子或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在一些实施方案中，所述启动子包含选自SEQIDNO：6-12中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述转基因序列是CpG优化的。在一些实施方案中，所述转基因序列包含SEQIDNO：19或20，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述核酸包含紧邻所述转基因序列的5′的Kozak序列。所述Kozak序列可包含例如SEQIDNO：17或18的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号选自猿猴病毒40(SV40)、人α-珠蛋白、兔α-珠蛋白、人β-珠蛋白、兔β-珠蛋白、人胶原蛋白、多瘤病毒、人生长激素(hGH)和牛生长激素(bGH)的聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化信号包含SEQIDNO：21-24中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述核酸还包含增强子。所述增强子可以是例如CMV增强子。在一些实施方案中，所述增强子包含SEQIDNO：4或5的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述核酸还包含内含子序列。所述内含子序列可以是例如嵌合序列或杂合序列。在一些实施方案中，所述内含子序列包含分离自或源自以下基因中的一者或多者的序列：β-珠蛋白、鸡β-肌动蛋白、小鼠微小病毒和人IgG。在一些实施方案中，所述内含子序列包含SEQIDNO：13-16中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述核酸还包含至少一个填充片段(stuffer)序列(例如，1、2、3、4或5个填充片段序列)。在一些实施方案中，所述至少一个填充片段序列包含SEQIDNO：25-27中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。本文还提供了一种载体(例如，AAV载体或质粒)，所述载体包含本公开的核酸。还提供了一种细胞，所述细胞包含本公开的核酸。还提供了一种产生重组AAV载体的方法，所述方法包括使AAV生产细胞与本公开的核酸或质粒/杆粒接触。还提供了一种通过这种方法产生的重组AAV载体。所述重组AAV载体可包含来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽AAV和牛AAV的衣壳蛋白。在一些实施方案中，与野生型AAV衣壳蛋白相比，所述AAV载体可包含具有一个或多个取代或突变的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述重组AAV载体是单链的(ssAAV)。在一些实施方案中，所述重组AAV载体是自身互补的(scAAV)。还提供了包含本公开的核酸、质粒、杆粒、细胞或重组AAV载体的组合物。还提供了一种用于治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的核酸、质粒、细胞或重组AAV载体。在一些实施方案中，所述受试者是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸，所述核酸从5’至3’包含：/n5’反向末端重复序列(ITR)；/n启动子；/n转基因序列；/n多聚腺苷酸化信号；以及/n3’ITR；/n其中所述转基因序列编码弗氏共济失调蛋白(FXN)蛋白。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181121 US 62/7702021.一种核酸，所述核酸从5’至3’包含：
5’反向末端重复序列(ITR)；
启动子；
转基因序列；
多聚腺苷酸化信号；以及
3’ITR；
其中所述转基因序列编码弗氏共济失调蛋白(FXN)蛋白。


2.如权利要求1所述的核酸，其中所述5’ITR和所述3’ITR中的至少一者的长度是约110至约160个核苷酸。


3.如权利要求1或2所述的核酸，其中所述5’ITR与所述3’ITR的长度相同。


4.如权利要求1或2所述的核酸，其中所述5’ITR和所述3’ITR具有不同的长度。


5.如权利要求1-4中任一项所述的核酸，其中所述5’ITR和所述3’ITR中的至少一者分离自或源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、禽AAV或牛AAV的基因组。


6.如权利要求1所述的核酸，其中所述5’ITR包含SEQIDNO:1的序列，或与其至少95％同一的序列。


7.如权利要求1-6中任一项所述的核酸，其中所述3’ITR包含SEQIDNO:2的序列，或与其至少95％同一的序列。


8.如权利要求1-7中任一项所述的核酸，其中所述3’ITR包含SEQIDNO:3的序列，或与其至少95％同一的序列。


9.如权利要求1-8中任一项所述的核酸，其中所述启动子驱动所述转基因的表达。


10.如权利要求1-9中任一项所述的核酸，其中所述启动子是组成型启动子。


11.如权利要求1-9中任一项所述的核酸，其中所述启动子是诱导型启动子。


12.如权利要求1-11中任一项所述的核酸，其中所述启动子是组织特异性启动子。


13.如权利要求1-12中任一项所述的核酸，其中所述启动子选自由以下组成的组：CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、多角体蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、EF-1α启动子、EF-1α短启动子、EF-1α核心启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、GUSB240启动子、GUSB379启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。


14.如权利要求13所述的核酸，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。


15.如权利要求13所述的核酸，其中所述启动子是EF-1α启动子、EF-1α短启动子或EF-1α核心启动子。


16.如权利要求13所述的核酸，其中所述启动子是GUSB240启动子。


17.如权利要求13所述的核酸，其中所述启动子是GUSB379启动子。


18.如权利要求13所述的核酸，其中所述启动子是PGK启动子。


19.如权利要求1-12中任一项所述的核酸，其中所述启动子包含选自SEQIDNO:6-12中任一者的序列，或与其至少95％同一的序列。


20.如权利要求1-19中任一项所述的核酸，其中所述FXN蛋白是人FXN蛋白。


21.如权利要求1-20中任一项所述的核酸，其中所述FXN蛋白具有SEQIDNO:65的序列，或与其至少95％同一的序列。


22.如权利要求1至21中任一项所述的核酸，其中所述转基因序列是CpG优化的。


23.如权利要求1-21中任一项所述的核酸，其中所述转基因序列包含SEQIDNO:19或20，或与其至少95％同一的序列。


24.如权利要求1-24中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含紧邻所述转基因序列的5’的Kozak序列。


25.如权利要求24所述的核酸，其中所述Kozak序列包含SEQIDNO:17或18的序列，或与其至少95％同一的序列。


26.如权利要求1-25中任一项所述的核酸，其中所述聚腺苷酸化信号选自猿猴病毒40(SV40)、人α-珠蛋白、兔α-珠蛋白、人β-珠蛋白、兔β-珠蛋白、人胶原蛋白、多瘤病毒、人生长激素(hGH)和牛生长激素(bGH)的聚腺苷酸化...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·托马斯，D·迪斯姆克，
申请(专利权)人：斯特里迪比奥公司，
类型：发明
国别省市：美国;US