一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及环境和生物检测技术领域，尤其是涉及一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法及其应用。定量检测方法包括以下步骤：(1)环境样本的采集和预处理；(2)基因组DNA提取；(3)宏基因组测序；(4)新型氯霉素抗性基因的比对和细菌16S rRNA基因数目的统计；(5)新型氯霉素抗性基因的定量分析。相比于现有的技术，本发明专利技术简便易行，无需构建标准质粒，不受样品类型的限制，检测时效性较高，且比对结果准确性较高，同时可准确实现对该基因在不同环境样品中的定量分析，大大提高了精准检测的时效性，有利于其在实际环境样品监测中进行推广。

【技术实现步骤摘要】
一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法及其应用
本专利技术涉及环境和生物检测
，尤其是涉及一种用于环境样本中新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法及其应用。
技术介绍
近年来，抗生素的广泛使用甚至大量滥用导致环境中的抗生素含量不断升高，俨然已经成为重要的环境问题。环境中抗生素的残留促进了具有抗生素耐受型细菌的增殖以及抗生素抗性基因的传播，严重威胁人类健康。氯霉素作为一类广谱抗生素，对鼠伤寒杆菌、大肠杆菌以及肺炎球菌等细菌具有良好的抑菌效果，因此在临床有较为广泛的应用。随着研究的不断深入及其广泛的使用，研究人员发现氯霉素的耐药性也在逐年上升，虽然世界上很多国家都已禁止氯霉素在兽医临床和食品动物中的使用，但目前环境中氯霉素残留量问题依然不容忽视。残留在环境中的抗生素会对环境中微生物产生选择压力，从而促进抗生素抗性基因(ARGs)在细菌间的传播并诱导新型ARGs产生。目前现有的新型ARGs检测技术主要是依赖于纯培养技术和分子生物学技术结合的方式，虽然该方式能够实现对新型ARGs的准确定性分析，但该方法验证周期长，操作较为复杂，而且无法实现对环境样品进行高通量检测，因此，需要开发一种简便快速的方法来对不同环境样品中新型氯霉素抗性基因进行快速准确的定量分析。
技术实现思路
为了解决上述
技术介绍
中所提出的问题，本专利技术的目的在于提供一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法及其应用，该方法操作简单易行，可大幅缩短检测周期，且检测结果准确度较高。为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一方面，本专利技术提供了一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，包括以下步骤：(1)环境样本的采集和预处理；(2)基因组DNA提取；(3)宏基因组测序；(4)新型氯霉素抗性基因的比对和细菌16SrRNA基因数目的统计；(5)新型氯霉素抗性基因的定量分析。进一步地，步骤(1)中所述环境样本包括地表水、反应器活性污泥和自来水。进一步地，步骤(1)中所述环境样本的预处理为：当环境样本为地表水和自来水时，使用0.22μm滤膜过滤，然后将滤膜放置-80℃保存；当环境样本为反应器活性污泥时，将反应器活性污泥通过6000-8000rpm，4℃离心10-15分钟，弃上清后收集沉淀，然后将沉淀放置-80℃保存。进一步地，步骤(3)中所述宏基因组测序采用的平台为IlluminaNovaSeq6000，测序策略为150PE。进一步地，步骤(4)中所述新型氯霉素抗性基因的比对为通过采用DIAMOND软件将双端数据与新型氯霉素抗性基因进行比对。进一步地，所述DIAMOND软件的具体参数设置如下：diamondblastx-dCL5-p16-qCL0-1_1.fq-f6-oCL0-1-e1e-10-k20--id95。进一步地，步骤(4)中所述细菌16SrRNA基因数目的统计为通过采用Metaxa2软件对样本中的16SrRNA基因的数目进行统计。进一步地，所述Metaxa2软件的具体参数设置如下：metaxa2-1CL0-1_1.fq-2CL0-1_2.fq-oCL0-1。进一步地，步骤(5)中所述新型氯霉素抗性基因的定量分析按照下列公式进行计算：其中，NARG-likesequence代表双端序列比对到数据库中抗性基因(ARG)的条数，Lreads代表测序数据的长度，LARGreferencesequence代表相应ARG参考基因的长度，N16Ssequence代表数据中16SrRNA基因的条数，L16Ssequence代表16SrRNA基因的长度，这里取值Greengene数据库中16SrRNA基因的平均长度1432bp，最终Abundance的单位为copyARG/copyof16SrRNAgene。另一方面，本专利技术提供了一种上述任一所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法的应用，用于环境样本中新型氯霉素抗性基因的测定。与现有的技术相比较，本专利技术具有如下显著特征和优点：1.本专利技术简便易行，无需构建标准质粒，不受样品类型的限制，可准确实现对该基因在不同环境样品中的定量分析，有利于其在实际环境样品监测中进行推广。2.本专利技术检测时效性较高，可在30分钟内完成对36G数据的抗性基因比对，且比对结果准确性较高，其相似度均高于98％，大大提高了精准检测的时效性。附图说明图1是本专利技术实施例2的DIAMOND比对结果。图2是本专利技术实施例3中Metaxa2对双端数据中16SrRNA基因的统计结果。具体实施方式以下将结合实施例对本专利技术的实施方法及结果分析进行详细地描述，以充分地理解本专利技术的特点和效果。这里需指出的是，所描述的实施例是叙述性的，不限定全部实施例，不能以此限定本专利技术的保护范围。实施例1：不同环境样品基因组DNA的提取和测序分别在水库和自来水厂采集地表水和自来水样品，装入1.5L的无菌玻璃瓶中，随后将其送回实验室进行后续处理。对于地表水和自来水样品用孔径为0.22μm的微孔滤膜进行过滤，将滤膜放置-80℃下保存至DNA提取。同时采集反应器中活性污泥样品，经8000rpm，4℃离心10分钟，收集沉淀并将其放置-80℃用于后续DNA提取。不同样品的DNA提取均采用FastDNATMSpinKit(MPBiomedicals,USA)试剂盒，具体步骤参考试剂盒使用说明。基因组DNA提取完成后，通过1％的琼脂糖凝胶电泳和NanoDropOne超微量分光光度计(ThermoFisherScientific,USA)检验基因组DNA的完整性和浓度，随后将获得的基因组DNA送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司利用IlluminaNovaSeq6000平台对其进行双端测序，测序长度为150bp。实施例2：新型氯霉素抗性基因的比对利用实施例1中得到的测序数据进行质控获得cleandata，随后采用DIAMOND软件将双端数据与新型氯霉素抗性基因进行比对，这里以氨基酸序列为SEQNo.1(MWPAGKVLGGGSSINGMMYVRGNRGDYDQWAQLGCKGWSYDDVLPFFNKAETNENGGSRFRGDKGPLRVSNARLSTTLADAFIASGVRAGIPHNPDTNGAEQEGIGPCQATQNKGWRHSTARAYLAKAKRRSNLKVETHFMVSRVLIEKGRAIGVEGVQNGRTVRYLANKEVILCGGALSSPKILMLSGIGPAKHLGEHGIPVVVDSPGVGQNLQEHPGVLMSTHVGIDSLNVEVQSVARIVKHGLNFALFGRGPATACVASALAFIRTRDHLEWPNIQLSFSPIAYDFTPDGVHLYKRAAIGVAINICRPETRGQLLLRSTDPSERPIIQHELLGGDDEIKQLIEGCRIVRKIFRSKPFSEYDKGERLPGKQVETDADWIEYIR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)环境样本的采集和预处理；/n(2)基因组DNA提取；/n(3)宏基因组测序；/n(4)新型氯霉素抗性基因的比对和细菌16S rRNA基因数目的统计；/n(5)新型氯霉素抗性基因的定量分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)环境样本的采集和预处理；
(2)基因组DNA提取；
(3)宏基因组测序；
(4)新型氯霉素抗性基因的比对和细菌16SrRNA基因数目的统计；
(5)新型氯霉素抗性基因的定量分析。


2.根据权利要求1所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述环境样本包括地表水、反应器活性污泥和自来水。


3.根据权利要求2所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述环境样本的预处理为：当环境样本为地表水和自来水时，使用0.22μm滤膜过滤，然后将滤膜放置-80℃保存；
当环境样本为反应器活性污泥时，将反应器活性污泥通过6000-8000rpm，4℃离心10-15分钟，弃上清后收集沉淀，然后将沉淀放置-80℃保存。


4.根据权利要求1所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述宏基因组测序采用的平台为IlluminaNovaSeq6000，测序策略为150PE。


5.根据权利要求4所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述新型氯霉素抗性基因的比对为通过采用DIAMOND软件将双端数据与新型氯霉素抗性基因进行比对。


6.根据权利要求5所述的新型氯霉素抗性基因的快速定量检测方法，其特征在于，所述DIAMOND软件的具体参数设置如下：dia...

【专利技术属性】
技术研发人员：李炳，梁贺彬，张家禹，黄锦，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44