硝基还原酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物医药领域，公开了一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法与应用。诊疗一体化探针的结构通式为

【技术实现步骤摘要】
硝基还原酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法与应用。
技术介绍
近十几年来恶性肿瘤的发病率和死亡率呈双高态势，已成为严重威胁人类健康的主要公共卫生问题之一，发展肿瘤的早期检测手段和有效治疗新方法是提高患者生活质量、降低死亡率的必由之路。诊疗一体化是一种兼具疾病的诊断和监测及药物治疗的新型生物医学技术，可同时具备肿瘤监测、抗肿瘤治疗、疗效评估等多重功能。缺氧是肿瘤微环境的重要特征之一，也是研究肿瘤早期诊断和治疗的关键靶点，缺氧微环境下，肿瘤细胞发生一系列代谢和生物学特性改变，包括硝基还原酶高表达，由此可见，发展硝基还原酶响应的诊疗一体化探针对于恶性肿瘤的早期诊断和有效治疗都将具有重大的意义。基于近红外荧光探针的近红外荧光成像可有效避免来自生物体的背景荧光干扰，且组织穿透能力强、对活体光损伤小，被广泛用于恶性肿瘤早期诊断的研究。光动力治疗是光敏剂利用光能将分子氧转化并产生活性氧，然后通过多因素机制杀死肿瘤细胞的新型肿瘤治疗模式。光动力治疗具有非侵入性、副作用少、抗癌谱广等优点，在临床肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。而合成具有光敏能力的近红外荧光探针则可在体内同时进行肿瘤的近红外成像和治疗，为肿瘤的诊疗一体化提供新的技术手段。
技术实现思路
针对上述问题本专利技术提供了一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针及其制备方法，旨在解决肿瘤早期诊断困难和有效治疗手段缺乏的技术问题。为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：本专利技术提供一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针，其结构通式如下：式中，R为甲基、乙基、丙基中的任意一种。本专利技术还提供了一种诊疗一体化探针的制备方法，包括如下步骤：步骤1，在有机溶剂中加入双氧水和三氟乙酸酐进行反应；步骤2，反应结束后，加入近红外荧光染料继续反应；步骤3，反应结束后，对反应液进行分离提纯，即可得到所述诊疗一体化探针。进一步，所述步骤1中有机溶剂至少为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇中的一种；所述步骤2中的近红外荧光染料的结构式为：式中，R为甲基、乙基、丙基中的任意一种。进一步，所述步骤1中的反应时间为10～100min，反应温度为-10～30℃；所述步骤2中的反应时间为0.5～6h，反应温度为0～40℃。进一步，所述步骤1中有机溶剂的体积为1～20mL，步骤2中近红外荧光染料与步骤3中的双氧水和三氟乙酸酐的摩尔比为1：3～9：4～12。进一步，所述步骤3中对反应液进行分离提纯的具体过程为，将反应液用二氯甲烷和水进行萃取，萃取后将有机相进行减压蒸馏，残渣经柱硅胶色谱柱分离，柱硅胶色谱柱分离的洗脱剂为体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇。更进一步，所述步骤1的最佳反应时间为30min，最佳反应温度为0℃；所述步骤2的最佳反应时间为2h，最佳反应温度为25℃。更进一步，所述步骤1中有机溶剂的最佳用量为2mL，所述步骤2中近红外荧光染料与步骤1中的双氧水和三氟乙酸酐的最佳摩尔比为1：6：8。本专利技术提供一种诊疗一体化探针的应用，应用于缺氧肿瘤细胞成像及光动力杀伤。本专利技术提供一种诊疗一体化探针的应用，用于活体肿瘤成像及肿瘤光动力治疗。与现有技术相比本专利技术具有以下优点：1、本专利技术的分析波长位于近红外区，可有效避免生物体背景荧光干扰，组织穿透力强，对活体光损伤小。2、本专利技术制备的硝基还原酶响应的诊疗一体化探针可对肿瘤组织缺氧环境中的硝基还原酶表现出近红外荧光增强响应，可实现肿瘤的近红外荧光成像诊断。3、本专利技术制备的硝基还原酶响应的诊疗一体化探针在近红外光辐照下，可对肿瘤细胞表现出显著的光毒性，可显著抑制裸鼠肿瘤生长，是一种优良的诊疗一体化探针。4、本专利技术制备的硝基还原酶响应的诊疗一体化探针具备良好的生物安全性，对裸鼠无明显毒性。5、本专利技术方法具有操作简便、成本低、快速、灵敏的优点，易于推广和应用。附图说明图1为实施例1合成的诊疗一体化探针的1HNMR图。图2为实施例1合成的诊疗一体化探针的13CNMR图。图3为实施例1合成的诊疗一体化探针的高分辨质谱图。图4为实施例1合成的诊疗一体化探针对硝基还原酶的紫外-可见吸收响应图，其中曲线a为实施例1合成的诊疗一体化探针(10μM)的吸收光谱，曲线b为实施例1合成的诊疗一体化探针(10μM)与硝基还原酶(400ng/mL)在NADH(250μM)存在下反应后的吸收光谱。图5为实施例1合成的诊疗一体化探针对不同浓度硝基还原酶的荧光响应图，图5中硝基还原酶的浓度从下到上依次为0，25，50，75，100，125，150，200，250，300，350，400和450ng/mL；NADH浓度为250μM。图6为实施例1合成的诊疗一体化探针对缺氧A549细胞的共聚焦成像图。图中第一列为荧光通道，第二列为白光通道，第三列为合并通道。图7为实施例1合成的诊疗一体化探针用于预先与硝基还原酶抑制剂双香豆素孵育过的缺氧A549细胞的共聚焦成像。图中第一列为荧光通道，第二列为白光通道，第三列为合并通道。图8为A549建模裸鼠瘤内注射实施例1合成的诊疗一体化探针后不同时间节点的活体荧光成像。每幅图的左侧为对照组，右侧为实验组。图9为DCFH-DA在实施例1合成的诊疗一体化探针(10μM)与硝基还原酶(400ng/mL)反应液中经660nm激光辐照后的荧光光谱。图9A为荧光光谱随激光辐照时间的变化，图中激光辐照时间从下到上依次为0，1，2，3，4，5，6，7，8和9min，功率密度为0.25W/cm2；图9B为荧光光谱随激光功率密度的变化，图中激光功率密度从下到上依次为0，0.05，0.10，0.15，0.20和0.25W/cm2，辐照时间为5min。图10为经实施例1合成的诊疗一体化探针处理的A549细胞的Calcein-AM/PI染色图。绿色通道代表活细胞，红色通道代表死细胞。图11为实施例7中不同治疗组裸鼠的肿瘤体积变化曲线。图12为实施例7中不同治疗组裸鼠在治疗21天后的肿瘤图片。图13为实施例8中不同治疗组裸鼠的体重变化曲线。图14为实施例8不同治疗组裸鼠在治疗21天后的主要血清生化指标。图15为实施例8不同治疗组裸鼠在治疗21天后各主要脏器及肿瘤组织的病理切片分析。具体实施方式以下结合实施例和附图对本专利技术技术方案做详细的说明。应当注意的是，所述实施例是对本专利技术的解释而不是限定。实施例1、硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备诊疗一体化探针按照下述路线合成：具体步骤：将H2O2(62μL，0.6mmol)和二氯甲烷(2mL)混合均匀，向其中滴加三氟乙酸酐(126μL，0.8mmol),0℃下搅拌30min后升至室温。然后将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针，其特征在于，结构通式如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针，其特征在于，结构通式如下：



式中，R为甲基、乙基、丙基中的任意一种。


2.一种权利要求1所述的硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，在有机溶剂中加入双氧水和三氟乙酸酐进行反应；
步骤2，反应结束后，加入近红外荧光染料继续反应；
步骤3，反应结束后，对反应液进行分离提纯，即可得到所述诊疗一体化探针。


3.根据权利要求2所述的一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中有机溶剂至少为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇中的一种；所述步骤2中的近红外荧光染料的结构式为：



式中，R为甲基、乙基、丙基中的任意一种。


4.根据权利要求2所述的一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的反应时间为10～100min，反应温度为-10～30℃；所述步骤2中的反应时间为0.5～6h，反应温度为0～40℃。


5.根据权利要求2所述的一种硝基还原酶响应的诊疗一体化探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽红，张琪，任国栋，张敏，刁海鹏，刘文，王浩江，王斌，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西;14