【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】保留空间邻近连续性信息的制备核酸的方法和组合物相关专利申请本申请要求于2018年12月27日提交的美国临时专利申请号62/785,643的权利，其名称为“保留空间邻近连续性信息的制备核酸的方法和组合物(METHODSANDCOMPOSITIONSFORPREPARINGNUCLEICACIDSTHATPRESERVESPATIAL-PROXIMALCONTIGUITYINFORMATION)”，指派AnthonySchmitt、CatherineTan、DerekReid、ChrisDeLaTorre和SiddarthSelvaraj是专利技术人，并分配了代理人案号AMG-1003-PV2。本申请还要求于2018年11月20日提交的美国临时专利申请号62/770,135的权利，其名称为“保留空间邻近连续性信息的核酸制备方法(METHODSFORPREPARINGNUCLEICACIDSTHATPRESERVESPATIAL-PROXIMALCONTIGUITYINFORMATION)”，指派AnthonySchmitt、CatherineTan、De...
【技术保护点】
1.一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：/na)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品；/nb)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；/nc)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；/nd)使所述脱蜡/再水化的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；/ne)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和/nf)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181120 US 62/770,135;20181227 US 62/785,6431.一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品；
b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；
c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；
d)使所述脱蜡/再水化的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；
e)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
f)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品是组织样品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在与裂解缓冲液接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV，
并且所述分散酶是分散酶I。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
7.根据权利要求6所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
8.根据权利要求7所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
9.根据权利要求8所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
10.根据权利要求9所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述温度是约74℃。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述温度是74℃。
15.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中与变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
19.根据权利要求18所述的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
21.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种用于区室化和用分子条形码进行标记的试剂接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其中一种或多种用于区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中用分子条形码进行标记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的固相基质复合的空间邻近核酸。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述转座酶是Tn5。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品设置在固体表面上。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
31.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括进行区室化和通过附着区室特异性分子条形码至所述增溶和解压缩的样品的核酸进行标记的试剂。
32.根据权利要求31所述的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm至约10μm的组织切片提供。
35.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
37.根据权利要求36所述的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
38.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
41.根据权利要求40所述的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
42.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约4年至约20年的存档期。
43.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约20年至约70年的存档期。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
47.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中从所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品获得的核酸小于200ng。
48.根据权利要求47所述的方法，其中步骤(f)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
51.根据权利要求50所述的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中在步骤(f)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述温度是约55℃。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述温度是55℃。
56.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中在步骤(f)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
57.根据权利要求56所述的方法，其中在步骤(f)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
58.一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品；
b)对所述样品进行脱蜡以产生脱蜡的样品；
c)使所述脱蜡的样品再水化，从而产生脱蜡/再水化的样品；
d)使所述脱蜡/再水化的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
e)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品是组织样品。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中在与变性洗涤剂接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
63.根据权利要求58至62中任一项所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
64.根据权利要求63所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
65.根据权利要求64所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
66.根据权利要求65所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
67.根据权利要求66所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
68.根据权利要求58至67中任一项所述的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述温度是约74℃。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述温度是74℃。
72.根据权利要求58至62中任一项所述的方法，其中与变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
73.根据权利要求58至72中任一项所述的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
74.根据权利要求58至73中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
76.根据权利要求75所述的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
77.根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
78.根据权利要求58至73中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
81.根据权利要求78至80中任一项所述的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种用于进行区室化和用分子条形码进行标记的试剂接触。
82.根据权利要求81所述的方法，其中一种或多种用于进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
83.根据权利要求81或82所述的方法，其中用分子条形码进行标记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
84.根据权利要求78所述的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含连接的条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的所述固相基质复合的空间邻近核酸。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述转座酶是Tn5。
86.根据权利要求58至85中任一项所述的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品提供在固体表面上。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
88.根据权利要求58至73中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括进行区室化和将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸的试剂。
89.根据权利要求88所述的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
90.根据权利要求88或89所述的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
91.根据权利要求58至90中任一项所述的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm至约10μm的组织切片提供。
92.根据权利要求91所述的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm的组织切片提供。
93.根据权利要求58至73中任一项所述的方法，其中所述保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
94.根据权利要求58至93中任一项所述的方法，其中步骤(e)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
95.根据权利要求94所述的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
96.根据权利要求58至93中任一项所述的方法，其中步骤(e)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
98.根据权利要求96或97所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
99.根据权利要求98所述的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
100.根据权利要求58至93中任一项所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约4年至约20年的存档期。
101.根据权利要求58至93中任一项所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约20年至约70年的存档期。
102.根据权利要求100或101所述的方法，其中步骤(e)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
104.根据权利要求102或103所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
105.根据权利要求58至93中任一项所述的方法，其中从所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品获得的核酸小于200ng。
106.根据权利要求105所述的方法，其中步骤(e)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
108.根据权利要求106或107所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
109.根据权利要求108所述的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
110.根据权利要求58至109中任一项所述的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
111.根据权利要求58至110中任一项所述的方法，其中在步骤(e)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
112.根据权利要求11所述的方法，其中所述温度是约55℃。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述温度是55℃。
114.根据权利要求58至110中任一项所述的方法，其中在步骤(e)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
115.根据权利要求114所述的方法，其中在步骤(e)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
116.一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品，所述样品尚未进行脱蜡/再水化；
b)使所述福尔马林固定石蜡包埋的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；
c)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
d)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品是组织样品。
118.根据权利要求116或117所述的方法，其中在与所述裂解缓冲液接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
121.根据权利要求116至120中任一项所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
122.根据权利要求121所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
123.根据权利要求122所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
124.根据权利要求123所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
125.根据权利要求124所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
126.根据权利要求116至125中任一项所述的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述温度是约74℃。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述温度是74℃。
130.根据权利要求116至120中任一项所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
131.根据权利要求116至130中任一项所述的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
132.根据权利要求116至131中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
134.根据权利要求133所述的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
135.根据权利要求132至134中任一项所述的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
136.根据权利要求116至131中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
138.根据权利要求136所述的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
139.根据权利要求136至138中任一项所述的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种用于进行区室化和用分子条形码进行标记的试剂接触。
140.根据权利要求139所述的方法，其中一种或多种用于进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
141.根据权利要求139或140所述的方法，其中用分子条形码进行标记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
142.根据权利要求136所述的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含连接的条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的所述固相基质复合的空间邻近核酸。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述转座酶是Tn5。
144.根据权利要求116至143中任一项所述的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品提供在固体表面上。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
146.根据权利要求116至131中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括进行区室化和将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸的试剂。
147.根据权利要求146所述的方法，其中进行区室化的所述一种或多种试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
148.根据权利要求146或147所述的方法，其中通过附着区室特异性分子条形码进行标记的所述一种或多种试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
149.根据权利要求116至148中任一项所述的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm至约10μm的组织切片提供。
150.根据权利要求116至131中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
151.根据权利要求116至150中任一项所述的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
152.根据权利要求151所述的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
153.根据权利要求116至150中任一项所述的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
154.根据权利要求153所述的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
155.根据权利要求153或154所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
156.根据权利要求155所述的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
157.根据权利要求116至150中任一项所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约4年至约20年的存档期。
158.根据权利要求116至150中任一项所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约20年至约70年的存档期。
159.根据权利要求157或158所述的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
161.根据权利要求159或160所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
162.根据权利要求116至150中任一项所述的方法，其中从所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品获得的核酸小于200ng。
163.根据权利要求162所述的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
164.根据权利要求163所述的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
165.根据权利要求163或164所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
166.根据权利要求165所述的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
167.根据权利要求116至166中任一项所述的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
168.根据权利要求116至167中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
169.根据权利要求168所述的方法，其中所述温度是约55℃。
170.根据权利要求169所述的方法，其中所述温度是55℃。
171.根据权利要求116至167中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
172.根据权利要求171所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
173.一种从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供福尔马林固定石蜡包埋的样品，所述样品尚未进行脱蜡/再水化；
b)使所述福尔马林固定石蜡包埋的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
c)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
174.根据权利要求173所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品是组织样品。
175.根据权利要求173或174所述的方法，其中在与变性洗涤剂接触之前，将所述脱蜡/再水化的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
176.根据权利要求175所述的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
177.根据权利要求176所述的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
178.根据权利要求173至177中任一项所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
179.根据权利要求178所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
180.根据权利要求179所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
181.根据权利要求180所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
182.根据权利要求181所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
183.根据权利要求173至182中任一项所述的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
184.根据权利要求183所述的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
185.根据权利要求184所述的方法，其中所述温度是约74℃。
186.根据权利要求185所述的方法，其中所述温度是74℃。
187.根据权利要求173至182中任一项所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
188.根据权利要求173至187中任一项所述的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
189.根据权利要求173至188中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
190.根据权利要求189所述的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
191.根据权利要求190所述的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
192.根据权利要求189至191中任一项所述的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
193.根据权利要求173至188中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
194.根据权利要求193所述的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
195.根据权利要求193所述的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
196.根据权利要求193至195中任一项所述的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种用于进行区室化和用分子条形码进行标记的试剂接触。
197.根据权利要求196所述的方法，其中一种或多种用于进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
198.根据权利要求196或197所述的方法，其中用分子条形码进行标记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
199.根据权利要求193所述的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含连接的条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的所述固相基质复合的空间邻近核酸。
200.根据权利要求199所述的方法，其中所述转座酶是Tn5。
201.根据权利要求173至200中任一项所述的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品提供在固体表面上。
202.根据权利要求201所述的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
203.根据权利要求173至188中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括进行区室化和将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸的试剂。
204.根据权利要求203所述的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
205.根据权利要求203或204所述的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
206.根据权利要求173至205中任一项所述的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm至约10μm的组织切片提供。
207.根据权利要求206所述的方法，其中将所述福尔马林固定石蜡包埋的样品作为厚度约5μm的组织切片提供。
208.根据权利要求173至188中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
209.根据权利要求173至208中任一项所述的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
210.根据权利要求209所述的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
211.根据权利要求173至208中任一项所述的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
212.根据权利要求211所述的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
213.根据权利要求211或212所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
214.根据权利要求213所述的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
215.根据权利要求173至208中任一项所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约4年至约20年的存档期。
216.根据权利要求173至208中任一项所述的方法，其中所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品具有约20年至约70年的存档期。
217.根据权利要求215或216所述的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
218.根据权利要求217所述的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
219.根据权利要求217或218所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
220.根据权利要求173至208中任一项所述的方法，其中从所述福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的样品获得的核酸小于200ng。
221.根据权利要求220所述的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
222.根据权利要求221所述的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
223.根据权利要求221或222所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
224.根据权利要求223所述的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
225.根据权利要求173至224中任一项所述的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
226.根据权利要求173至225中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
227.根据权利要求226所述的方法，其中所述温度是约55℃。
228.根据权利要求227所述的方法，其中所述温度是55℃。
229.根据权利要求173至225中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
230.根据权利要求229所述的方法，其中在步骤(c)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
231.一种从深度福尔马林固定的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供深度福尔马林固定的样品；
b)使所述深度福尔马林固定的样品与裂解缓冲液接触，从而产生裂解的样品；
c)使所述裂解的样品与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触，从而产生增溶和解压缩的样品；和
d)使所述增溶和解压缩的样品与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述增溶和解压缩的样品的核酸中的空间邻近连续性信息。
232.根据权利要求231所述的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品是组织样品。
233.根据权利要求231或232所述的方法，其中在与裂解缓冲液接触之前，将所述深度福尔马林固定的样品与细胞外基质蛋白酶接触。
234.根据权利要求233所述的方法，其中所述蛋白酶是胶原酶和/或分散酶。
235.根据权利要求234所述的方法，其中所述胶原酶是Coll、ColIII或ColIV并且所述分散酶是分散酶I。
236.根据权利要求231至235中任一项所述的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品是磨碎的。
237.根据权利要求231至236中任一项所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触超过10分钟。
238.根据权利要求237所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是15至80分钟。
239.根据权利要求238所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是30至50分钟。
240.根据权利要求239所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是约40分钟。
241.根据权利要求240所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是40分钟。
242.根据权利要求231至241中任一项所述的方法，其中所述温度高于65℃并且低于80℃。
243.根据权利要求242所述的方法，其中所述温度是70℃至80℃。
244.根据权利要求243所述的方法，其中所述温度是约74℃。
245.根据权利要求244所述的方法，其中所述温度是74℃。
246.根据权利要求231至236中任一项所述的方法，其中与所述变性洗涤剂的接触是在74℃的温度下持续40分钟。
247.根据权利要求231至246中任一项所述的方法，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
248.根据权利要求231至247中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
249.根据权利要求248所述的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下试剂中的一种或多种：至少一种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
250.根据权利要求249所述的方法，包括两种限制性核酸内切酶。
251.根据权利要求248至250中任一项所述的方法，其中所述邻近连接的核酸分子是原位产生的。
252.根据权利要求231至247中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括固相元素，所述固相元素与所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸形成复合物，以产生与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的空间邻近核酸。
253.根据权利要求252所述的方法，其中所述固相元素是用核酸交联剂官能化的固相基质。
254.根据权利要求252所述的方法，其中所述固相元素是用亲和纯化分子官能化的固相基质，并且所述核酸分子被亲和纯化标记物标记。
255.根据权利要求252至254中任一项所述的方法，其中与固相元素复合的所述增溶和解压缩的样品的所述空间邻近核酸与一种或多种用于进行区室化和用分子条形码进行标记的试剂接触。
256.根据权利要求255所述的方法，其中一种或多种用于进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
257.根据权利要求255或256所述的方法，其中用分子条形码进行标记是通过引物延伸聚合(PEP)或通过连接进行。
258.根据权利要求252所述的方法，其中所述固相元素是用包含条形码化的寡核苷酸的转座酶官能化的固相基质，所述固相基质产生包含连接的条形码化的寡核苷酸并与被转座酶官能化的所述固相基质复合的空间邻近核酸。
259.根据权利要求258所述的方法，其中所述转座酶是Tn5。
260.根据权利要求231至259中任一项所述的方法，其中将所述深度福尔马林固定的样品提供在固体表面上。
261.根据权利要求260所述的方法，其中所述固体表面是病理玻片。
262.根据权利要求231至247中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括进行区室化和将区室特异性分子条形码附着至所述增溶和解压缩的样品的核酸的试剂。
263.根据权利要求262所述的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂是产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
264.根据权利要求262或263所述的方法，其中一种或多种通过附着区室特异性分子条形码进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
265.根据权利要求231至247中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
266.根据权利要求231至265中任一项所述的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸。
267.根据权利要求266所述的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序，以确定所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸的甲基化状态。
268.根据权利要求231至265中任一项所述的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
269.根据权利要求268所述的方法，其中所述测序是处于30X或更小的深度。
270.根据权利要求268或269所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
271.根据权利要求270所述的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
272.根据权利要求231至265中任一项所述的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品具有约4年至约20年的存档期。
273.根据权利要求231至265中任一项所述的方法，其中所述深度福尔马林固定的样品具有约20年至约70年的存档期。
274.根据权利要求272或273所述的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
275.根据权利要求274所述的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
276.根据权利要求274或275所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
277.根据权利要求231至265中任一项所述的方法，其中从所述深度福尔马林固定的样品获得的核酸小于200ng。
278.根据权利要求277所述的方法，其中步骤(d)产生具有保留的空间邻近连续性信息的核酸，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的核酸进行测序以产生序列读数。
279.根据权利要求278所述的方法，其中所述测序处于30X或更小的深度。
280.根据权利要求278或279所述的方法，其中所述序列读数的长距离顺式读数的百分比大于不与变性洗涤剂在高于65℃的温度下接触而产生的长距离顺式读数的百分比。
281.根据权利要求280所述的方法，其中长距离顺式读数的百分比大于读数的40％。
282.根据权利要求231至281中任一项所述的方法，其中所述方法基本上使用自动化设备进行。
283.根据权利要求231至282中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过使所述样品与蛋白酶K在低于68℃的温度下接触约30分钟来使交联逆转。
284.根据权利要求283所述的方法，其中所述温度是约55℃。
285.根据权利要求284所述的方法，其中所述温度是55℃。
286.根据权利要求231至282中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在约95℃的温度下孵育约1小时来使交联逆转。
287.根据权利要求286所述的方法，其中在步骤(d)之后，通过将所述样品在不存在蛋白酶K的情况下在95℃的温度下孵育1小时来使交联逆转。
288.一种从包含蛋白质:cfDNA复合物的样品制备保留空间邻近连续性信息的核酸的方法，包括：
a)提供包含蛋白质:cfDNA复合物的样品；
b)使所述蛋白质:cfDNA复合物与相邻的蛋白质:cfDNA复合物交联；和
c)使交联的蛋白质:cfDNA复合物与一种或多种试剂接触，所述试剂保留所述样品的细胞游离DNA中的空间邻近连续性信息。
289.根据权利要求288所述的方法，其中所述样品是血清、血浆或尿。
290.根据权利要求288或289所述的方法，其中所述蛋白质:cfDNA复合物是核小体复合物或染色体复合物。
291.根据权利要求288至290中任一项所述的方法，其中在交联之前将所述样品中的蛋白质:cfDNA复合物与固相接触，从而产生与固相结合的蛋白质:cfDNA复合物。
292.根据权利要求291所述的方法，其中所述固相结合所述蛋白质:cfDNA复合物。
293.根据权利要求291或292所述的方法，其中所述交联剂是甲醛。
294.根据权利要求288至293中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括产生邻近连接的核酸分子的试剂。
295.根据权利要求294所述的方法，其中所述产生邻近连接的核酸分子的试剂包括以下一种或多种：限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、包含至少一个生物素化核苷酸的多个核苷酸，和连接酶。
296.根据权利要求288至293中任一项所述的方法，其中所述保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括Tn5四聚体。
297.根据权利要求288至293中任一项所述的方法，其中所述蛋白质:cfDNA复合物从固体载体释放，并且所述保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括对从所述固体载体释放的所述蛋白质:cfDNA复合物进行区室化并用区室特异性分子条形码对区室化的蛋白质:cfDNA复合物进行标记的试剂。
298.根据权利要求297所述的方法，其中一种或多种进行区室化的试剂包括产生微流体液滴的微流体区室化装置或将复合物稀释到其中的微量滴定板孔。
299.根据权利要求297或298所述的方法，其中一种或多种用区室特异性分子条形码对区室化的蛋白质:cfDNA复合物进行标记的试剂包括用于引物延伸聚合(PEP)的试剂、用于连接的试剂或包含条形码化的寡核苷酸的转座酶。
300.根据权利要求297至299中任一项所述的方法，进一步包括一种或多种试剂以亲和纯化所述蛋白质:cfDNA复合物。
301.根据权利要求288至293中任一项所述的方法，其中保留空间邻近连续性信息的一种或多种试剂包括结合至固相的Tn5。
302.根据权利要求301所述的方法，其中所述Tn5包含虚拟区室特异性分子条形码。
303.根据权利要求288至302中任一项所述的方法，其中步骤(c)产生具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA，并且对所述具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA进行亚硫酸氢盐处理以产生经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA。
304.根据权利要求303所述的方法，其中对所述经亚硫酸氢盐处理的具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA进行测序，以确定具有保留的空间邻近连续性信息的细胞游离DNA的甲基化状态。
305.根据权利要求288至302中任一项所述的方法，其中步骤(c)产...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·施米特，C·谭，D·里德，C·德拉托雷，S·塞尔瓦拉，
申请(专利权)人：阿瑞玛基因组学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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