以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法技术

本发明专利技术公开一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，采用单溶酶体膜片钳技术获得细胞内单个溶酶体的内容物；对溶酶体的内容物进行质谱检测获得溶酶体内容物中代谢物的组成及含量；根据检测的结果，依据单个溶酶体内容物中代谢物组成和含量的差异，对溶酶体进行分类，得到五种不同亚群的溶酶体，其中包括已知的自噬溶酶体和内吞溶酶体。本发明专利技术实现对溶酶体更精细的分类，采用本发明专利技术的方法可以将溶酶体分为五类，各类溶酶体均具有明显的分类标志物。研究人员研究溶酶体在衰老、退行性疾病如研制治疗阿尔兹海默病、癌症的药物代谢等领域的各类溶酶体特异性功能提供了线索。

【技术实现步骤摘要】
以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法
本专利技术涉及溶酶体分类领域，具体为一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法。
技术介绍
溶酶体是细胞内主要的降解性细胞器，是细胞代谢的关键位点。溶酶体的功能异常与多种疾病密切相关，如溶酶体贮积症、神经退行性疾病、肿瘤等，因此溶酶体也是疾病治疗和药物开发的重要靶点。此外，溶酶体也参与药物的细胞内转运、储存和代谢，与多种药物的耐药性直接相关。细胞中往往存在大量的溶酶体，这些溶酶体在大小、形态和功能等方面存在巨大的异质性，不同的溶酶体在疾病和药物代谢中往往也发挥不同的作用，因此对溶酶体进行分类，分别研究不同类型溶酶体的特点和差异，对疾病机制的研究和药物开发有重要的科学意义和广阔的应用前景。目前常根据溶酶体的成熟阶段或与其他细胞器的融合来对溶酶体进行分类，这些分类方式非常粗略，且缺少明显的分类标志物，尤其是无法根据溶酶体代谢的差异对其进行分类，导致目前对疾病中溶酶体的功能认识不足，也极大地限制了靶向溶酶体的药物开发。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，来解决现有技术对溶酶体分类精细度差的技术问题。为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，所述溶酶体分类包括以下步骤：步骤一、采用单溶酶体膜片钳技术处理细胞，获得单溶酶体的内容物；步骤二、对单溶酶体的内容物分别进行质谱检测；步骤三、根据步骤二检测的结果，以内容物中的代谢物为对象，进行溶酶体的分类。溶酶体至少能分为五个亚群。本专利技术通过将单溶酶体膜片钳取样技术与质谱检测技术进行有机结合，建立了单溶酶体质谱分析方法。实现了对单个溶酶体内容物进行质谱检测，从而对溶酶体内容物成分及含量进行分析，相对于传统的溶酶体匀浆的分析方法，单溶酶体质谱分析方法更能如实地反映溶酶体的代谢状态，也是本专利技术能够以溶酶体的代谢物为对象进行溶酶体分类的关键。基于上述方法，本专利技术实现了以代谢物的组成及含量为指标对溶酶体精细的分类，实验表明，采用本专利技术的方法可以将溶酶体分为五类，各类溶酶体均具有明显的分类标志物。为研究人员研究溶酶体在衰老、退行性疾病如研制治疗阿尔兹海默病、癌症的药物代谢等领域的各类溶酶体特异性功能提供了线索。进一步，所述步骤一中的细胞为HEK-293T细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠肺成纤维细胞(MLF)、膀胱癌细胞(T24)、人膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)、BxPC-3细胞、小鼠心肌细胞、心脏成纤维细胞、小鼠大脑皮层神经元、神经胶质细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠淋巴成纤维细胞中的至少一种。进一步，所述步骤一中的单溶酶体膜片钳技术采用的玻璃电极其电极尖端为5-10mm长，电极尖端开口直径为0.1-2μm。以防止样品被电极外液稀释；质谱取样的电极外液是模拟溶酶体所处的胞质离子环境。如此，可以获得pL/min的喷雾速度并对物质的检测具有较高的重现性和灵敏度，对于赖氨酸(LYS)，组氨酸(HIS)以及精氨酸(ARG)的检测限分别是0.045μM，0.042μM和0.038μM。进一步，所述步骤一采用的细胞为HEK-293T细胞；第一亚群对应的标志性代谢物包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸等阳离子氨基酸，第二亚群对应的标志性代谢物包括氧化己二酸、烟尿酸和香草扁桃酸等氨基酸衍生物，第三亚群对应的标志性代谢物包括甘油三酯、磷脂酰胆碱、甘油三酯和甘油二酯，第四亚群对应的标志性代谢物包括丁基肉碱，乙酰肉碱和马来酸均聚物，第五亚群对应的标志性代谢物包括磷脂酰肌醇双磷酸、双磷脂酰甘油、和甘油三酯。优选地，所述五个亚群中存在一个亚群标记为内吞溶酶体，存在另一个亚群标记为自噬溶酶体。优选地，在进行所述步骤一时，还获得单溶酶体的电生理信号。如此，本专利技术实现了既能获得单个溶酶体的内容物成分信息，同时能获得单个溶酶体的电生理信号。进一步，获得单溶酶体的电生理信号所使用的电极外液包括K-gluconate、NaCl、MgCl2、CaCl2、HEPES；电极内液包括NH4HCO3、NH4Cl。进一步，填充电极内液的电极电阻为5-16MΩ。进一步，本专利技术采用NH4Cl电极内液，与传统电极内液相比，提高了质谱检测的信噪比，可以同时获得电生理和质谱信号。进一步，步骤一中，在采用单溶酶体膜片钳技术的玻璃电极对单溶酶体处理之前，进行溶酶体的增大处理。由于细胞器(如溶酶体、内体)太小，用玻璃电极可能不容易直接取样，因此，对细胞器的增大处理，便于单细胞器质谱取样。进一步，所述溶酶体的增大处理通过采用vacuolin-1对细胞进行处理。本专利技术还公开一种单溶酶体代谢物信息的获取方法，包括以下步骤：步骤一、培养细胞；步骤二、将培养后的细胞进行转染；步骤三、通过单溶酶体膜片钳技术获取细胞中单溶酶体的电生理信号并获得单溶酶体的内容物；步骤四、通过质谱检测对内容物的成分进行定性定量分析，获取单溶酶体中代谢物信息。本专利技术的优点在于：本专利技术通过将单溶酶体膜片钳取样技术与质谱检测技术进行有机结合，建立了单溶酶体质谱分析方法。实现了对单个溶酶体内容物进行质谱检测，从而对溶酶体内容物成分及含量进行分析，相对于传统的溶酶体匀浆的分析方法，单溶酶体质谱分析方法更能如实地反映溶酶体的代谢状态，也是本专利技术能够以溶酶体的代谢物为对象进行溶酶体分类的关键。基于上述方法，本专利技术实现了以代谢物的组成及含量为指标对溶酶体精细的分类，实验表示，采用本专利技术的方法可以将溶酶体分为五类。为研究人员研究溶酶体在衰老、退行性疾病如研制治疗阿尔兹海默病、癌症的药物代谢等领域的各类溶酶体特异性功能提供了线索。附图说明图1为本专利技术中HEK-293T细胞的t-SNE聚类分析图。图2为本专利技术中各个玻璃电极其尖端形状的示意图。图3为本专利技术中不同形状的玻璃电极情况下检测的赖氨酸相对含量柱状图。图4为本专利技术中不同形状的玻璃电极情况下检测的组氨酸相对含量柱状图。图5为本专利技术中不同形状的玻璃电极情况下检测的精氨酸相对含量柱状图。图6为本专利技术中抽取的ALF的TIC与SIC的质谱峰图。其中，喷雾流速为3.2pL/min。SIC表示选择离子流；TIC表示总离子流。图7为本专利技术中增大的细胞器在HEK-293T细胞中的分布图。图8为本专利技术中HEK-293T细胞的内体和溶酶体的2-Hydroxyatrazine的质谱峰图。图9为本专利技术中HEK-293T细胞的内体和溶酶体中2-Hydroxyatrazine相对含量的统计图。图10为本专利技术中HEK-293T细胞的内体和溶酶体的Cytosine的质谱峰。图11为本专利技术中HEK-293T细胞的内体和溶酶体中Cytosine相对含量的统计图。图12为本专利技术中HEK-293T细胞的内体和溶酶体的代谢物相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一、采用单溶酶体膜片钳技术处理细胞，获得单溶酶体的内容物；/n步骤二、对单溶酶体的内容物进行质谱检测；/n步骤三、根据步骤二检测的结果，以内容物中的代谢物为对象，进行溶酶体的分类。/n

【技术特征摘要】
1.一种以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、采用单溶酶体膜片钳技术处理细胞，获得单溶酶体的内容物；
步骤二、对单溶酶体的内容物进行质谱检测；
步骤三、根据步骤二检测的结果，以内容物中的代谢物为对象，进行溶酶体的分类。


2.根据权利要求1所述的以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，所述步骤一中的细胞为HEK-293T细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠肺成纤维细胞、膀胱癌细胞、人膀胱上皮永生化细胞、BxPC-3细胞、小鼠心肌细胞、心脏成纤维细胞、小鼠大脑皮层神经元、神经胶质细胞、小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠淋巴成纤维细胞的至少一种。


3.根据权利要求1所述的以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，所述步骤三中的溶酶体被分为至少五个亚群。


4.根据权利要求1所述的以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，所述步骤一采用的细胞为HEK-293T细胞；所述步骤三中溶酶体被分为五个亚群。


5.根据权利要求4所述的以溶酶体的代谢物为标志物进行溶酶体分类的方法，其特征在于，所述五个亚群分别为第一亚群、第二亚群、第三亚群、第四亚群、第五亚群；其中，
第一亚群对应的标志性代谢物包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸等阳离子氨基酸，第二亚群对应的标志性代谢物包括氧化己二酸、烟尿酸和香草扁桃酸等氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊伟，朱洪影，仓春蕾，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34