用于检测活微生物的方法和流体管道系统技术方案

本发明专利技术提出提供用于借助于待检测的微生物(1)的原位杂交(14)，特别是荧光原位杂交，和光学分析(26)来在样品(9)中检测活微生物(1)和/或区分活微生物(12)和死微生物(13)的方法(7)，其中在所述杂交(14)之前向所述样品(9)附加至少一种物质(10)，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的RNA浓度的不同的变化。

【技术实现步骤摘要】
用于检测活微生物的方法和流体管道系统本专利技术涉及用于借助于待检测的微生物的原位杂交，特别是荧光原位杂交，和光学分析来在样品中检测活微生物和/或区分活微生物和死微生物的方法，其中在所述杂交之前向所述样品附加至少一种物质，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的核酸浓度，特别是RNA浓度和/或DNA浓度的不同的变化。为了检测在单个细胞中的核酸，例如已知诸如原位杂交(ISH)以及荧光原位杂交(FISH)的方法。在这种情况下，使用短的合成核酸探针，其通过碱基配对与待检测的目标序列相结合。原位杂交和荧光原位杂交(其中对核酸探针进行了荧光标记)可以用于核酸(DNA和/或RNA分子)的特异性检测。核酸的特异性检测例如应用于生产控制和/或质量控制中。对于许多来自不同的工业、卫生或餐饮业领域的物质、原料和产品，重要的是，可以保证微生物学安全。例如，可以在表面清洁方法中以这种方式检查清洁/消毒是否成功。用分子生物学方法，例如PCR，可以在几个小时中检测微生物的核酸。然而，在这种情况下，查出的是活和死微生物的所有微生物的总DNA/RNA。然而，对于医疗卫生评价来说紧要的仅是能够引起感染的微生物，而不是不再能够导致疾病的已经死去的微生物。因此，对于检测方法来说重要的是，在活微生物和死微生物之间进行区分。在这种背景下，本专利技术的任务是提供简单且快速的用于在样品中检测微生物的方法，其使得将活微生物与死微生物区别开成为可能，并且此外是在实验室环境之外可施行的。根据本专利技术，该任务通过权利要求1的特征而得到解决。特别地，因此为了在具有开头所描述的类型的方法中解决所述及的任务，根据本专利技术提出，在杂交之前向待调查的样品附加至少一种物质，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的核酸浓度，特别是RNA浓度和/或DNA浓度的不同的变化。为此，本专利技术利用了下述事实：通过在杂交之前向样品附加至少一种有助于在死细胞中和在活细胞中的核酸浓度的不同的变化的物质，可以使得在活微生物和死微生物之间的区分成为可能。例如，可以降低在死细胞中的RNA浓度和/或DNA浓度，和/或提高在活细胞中的RNA浓度和/或DNA浓度。备选地或另外地，可以以不同速度降低在死细胞和活细胞中的RNA浓度和/或DNA浓度。备选地或另外地，可以更改检测试剂对于在死细胞或活细胞中的RNA和/或DNA的可接近性。备选地或另外地，可以将其他检测试剂作为“活”或“死”指示剂引入到细胞中，并且同样地作为信息读出。根据本专利技术的一个有利的实施方案预先规定，所附加的物质包含至少一种降解RNA和/或DNA的化学物质。所述降解RNA和/或DNA的化学物质可以是酶。例如，其为DNA酶。所附加的物质也可以是RNA酶。在这种情况下有利的是，RNA酶可以侵入死细胞(其可渗透性比活细胞高得多，即常常以提高的渗透性而出众)中，并且在细胞空间中是有酶促活性的。由此可以去除死颗粒，这可以显著地改善活/死区分。所附加的物质也可以包含有助于RNA降解和/或DNA降解的化学物质。例如，该物质为乙二胺四乙酸盐(EDTA)，其也可以用作金属酶的保护物质。在一个有利的实施方案中，EDTA的浓度为0.1-2M，优选地0.1-1M，特别优选地0.5M。也可以使用其他物质，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、RNA解旋酶、聚合酶、蛋白伴侣或siRNA。但是，备选地或另外地，所附加的物质也可以包含提高死细胞中的渗透性的化学物质。特别地，其为胞壁质水解酶、溶菌酶、变溶菌素、葡糖胺酶、肽酶或酰胺酶。作为肽酶(即裂解蛋白质或肽的酶)，可以使用外肽酶和/或内肽酶，取决于在待裂解的多肽链内的定位。备选地或另外地，在所附加的物质中也可以包含有助于活细胞中的RNA合成和/或DNA合成的选择性或非选择性营养介质。例如，其为蛋白胨水、CASO-肉汤、DEV乳糖-肉汤、MRS培养基、巯基乙酸盐肉汤、脑心浸液肉汤、酪蛋白蛋白胨-大豆粉蛋白胨-肉汤、GN-(革兰氏阴性)富集肉汤，例如Hajna和/或LB培养基。此外，根据本专利技术的一个有利的实施方案预先规定，将所述微生物在至少附加了所述物质的情况下进行温育。特别地，在所述杂交之前进行所述微生物的温育。在这种情况下，可以如此地安排温育时间，从而使得细胞分裂还未发生。由此可以使死细胞作为假阳性信号被捕获的概率下降几个数量级，因为这些死颗粒通过在杂交之前的微生物的温育而大大减少了。根据本专利技术的一个有利的实施方案预先规定，所述杂交包括固定步骤、渗透化步骤和变性步骤中的至少两个步骤。特别地，可以预先规定，所述固定通过变性物质来进行。这使得杂交缓冲液的有利组成成为可能，其中可以使用相同的工具用于固定和变性。也可以预先规定，在所述杂交中包括固定步骤、渗透化步骤和变性步骤中的所有步骤。有利地，所述杂交在杂交缓冲液中进行。所述杂交缓冲液包含例如无毒物质，特别是氯化胍和/或尿素作为变性物质。备选地或另外地，作为变性物质，也可以使用硫氰酸胍和/或甲酰胺。但是，尿素的使用是优选的。由此确保了，使用氯化胍和/或尿素(代替对水有害的物质或者代替有毒的甲酰胺)使得在没有实验室的情况下使用根据本专利技术的方法成为可能。在这种情况下，有利的是，所述试剂可以以干燥形式预先存放，和随后以生活垃圾被清除。在一个有利的实施方案中，氯化胍的浓度为0.1-2M，优选地0.1-1M，特别优选地0.5M。在这种情况下，有利的是，以超过0.25M的浓度的氯化胍可以提供随着浓度提高而增加的针对RNA酶的保护。备选地，可以使用由氯化胍和尿素组成的混合物，以5.3M尿素与0.5M氯化胍的优选的浓度。这使得经改善的针对RNA酶的保护成为可能。对于利斯特氏菌(Listeria)FISH不需要变性试剂。根据本专利技术的一个有利的实施方案预先规定，在所述杂交，特别是固定步骤结束之前，向所述样品添加去污剂。在这种情况下，有利的是，通过向所述样品添加去污剂，可以使得检测探针有效地侵入细胞中成为可能。例如，所述去污剂为十二烷基硫酸钠(SDS)。对于利斯特氏菌FISH不需要变性试剂。在一个有利的实施方案中，SDS的浓度为0.003％-0.05％。对于利斯特氏菌FISH，SDS的浓度为0.075％。通过在固定步骤结束之前添加去污剂，可实现的可以是，可以随后检测未裂解的独个微生物。特别地，不在固定开始之前添加去污剂。在固定开始之前添加去污剂(在该情况下阻止了微生物的构造的进一步变化)将会使得在单个微生物中通过杂交而产生的反应产物的检测变得困难。备选地或另外地，可以预先规定，在所述杂交之前进行在所述样品中所包含的微生物的活/死区分。因此，可以使得检测仅仅活微生物成为可能。根据本专利技术的一个有利的实施方案预先规定，所述杂交缓冲液包含至少一种变性剂和抑制RNA酶的物质。由此可以使核酸杂交体稳定化并且还保证针对RNA酶的保护。对于在利斯特氏菌FISH中的活/死区分，既不使用变性剂也不使用RNA酶抑制剂。根据本专利技术的一个有利的实施方案预先规定，所述抑制RNA酶的物质选自氯化胍、硫氰酸胍、甲酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于借助于待检测的微生物(1)的原位杂交(14)，特别是荧光原位杂交，和光学分析(26)来在样品(9)中检测活微生物(1)和/或区分活微生物(12)和死微生物(13)的方法(7)，其特征在于，在所述杂交(14)之前向所述样品(9)附加至少一种物质(10)，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的核酸浓度，特别是RNA浓度和/或DNA浓度的不同的变化。/n

【技术特征摘要】
20200214 DE 102020103971.91.用于借助于待检测的微生物(1)的原位杂交(14)，特别是荧光原位杂交，和光学分析(26)来在样品(9)中检测活微生物(1)和/或区分活微生物(12)和死微生物(13)的方法(7)，其特征在于，在所述杂交(14)之前向所述样品(9)附加至少一种物质(10)，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的核酸浓度，特别是RNA浓度和/或DNA浓度的不同的变化。


2.根据权利要求1的方法(7)，其特征在于，所附加的物质(10)包含至少一种降解RNA和/或DNA的化学物质，特别是RNA酶(15)和/或DNA酶，和/或有助于RNA降解和/或DNA降解的化学物质，特别是乙二胺四乙酸盐(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、RNA解旋酶、聚合酶、蛋白伴侣、siRNA，和/或至少一种提高死细胞中的渗透性的化学物质，特别是胞壁质水解酶、溶菌酶、变溶菌素、葡糖胺酶、肽酶、酰胺酶，和/或有助于活细胞中的RNA合成的营养介质。


3.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，将所述微生物(1)在至少附加了所述物质(10)的情况下进行温育(11)，特别是在所述杂交(14)之前，和/或其中如此地安排温育时间，从而使得细胞分裂还未发生。


4.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述杂交(14)包括固定(24)步骤、渗透化步骤和变性步骤中的至少两个步骤，优选地所有步骤，优选地在杂交缓冲液中，和/或所述杂交缓冲液包含无毒物质，特别是氯化胍和/或尿素和/或硫氰酸胍和/或甲酰胺作为变性物质。


5.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，在所述杂交(14)，特别是固定步骤结束之前，向所述样品(9)添加去污剂(21)，和/或在所述杂交(14)之前进行在所述样品(9)中所包含的微生物(1、12、13、27)的活-死区分。


6.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述杂交缓冲液包含至少一种变性剂和抑制RNA酶的物质。


7.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述抑制RNA酶的物质选自由下列各项组成的组：氯化胍、硫氰酸胍、甲酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、低聚乙烯基磺酸、多聚乙烯基磺酸、乙磺酸、肝素、谷胱甘肽、天然核苷和核苷酸。


8.根据前述权利要求之一...

【专利技术属性】
技术研发人员：Z·瓦西莱乌斯卡娅舒尔兹，P·凯尔，S·布斯，J·莱迈，S·鲁登，D·巴拉格，
申请(专利权)人：泰斯托生物分析有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE