人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN的鉴定和应用制造技术

本发明专利技术涉及人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN在制备促进精原干细胞增殖制品中的应用及分泌蛋白POSTN的鉴定方法，鉴定方法的步骤为人羊膜间充质干细胞条件培养基的收取；质谱分析条件培养基中羊膜间充质干细胞外分泌蛋白，筛选出高表达蛋白POSTN。本发明专利技术鉴定了羊膜间充质干细胞外分泌蛋白组，并对结果进行了分析整合，筛选出精原干细胞增殖积极因子POSTN，对后续羊膜干细胞旁分泌作用的研究提供了详实的基础和新的思路。POSTN为精原干细胞体外增殖提供了新的细胞因子，为更好的挖掘羊膜干细胞外分泌蛋白的特点提供了方向。

【技术实现步骤摘要】
人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN的鉴定和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白-骨膜蛋白(periostin，POSTN)的鉴定和应用。
技术介绍
间充质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）已被证明能够分泌各种自分泌/旁分泌因子，包括生长因子和细胞因子，这些因子在细胞治疗过程中起很大作用。人羊膜在分娩后常被当作生物废物丢弃，成为羊膜间充质干细胞（hAMSCs）的重要来源。此外，它还有许多其他优点，如抗炎、抗菌、抗血管生成特性和低免疫原性。HAMSC分泌因子用于急性脑损伤的无细胞治疗。我们在hAMSCs条件培养基（hAMSCs-CM）中发现了许多与细胞增殖有关的蛋白质。骨膜蛋白(periostin,POSTN)是一种由836个氨基酸组成、大小约90kD的细胞外基质蛋白。POSTN在体内广泛表达，在主动脉、胃、下消化道、胎盘、子宫、甲状腺组织和乳腺中水平最高。它主要在个体发育过程中和成人结缔组织暴露于机械负荷时产生，如心脏瓣膜、皮肤、牙周韧带、肌腱和骨骼。此外，POSTN在受伤后的愈合过程中也起着关键作用。POSTN有两种作用途径，一种是通过与细胞外基质成分相互作用来驱动胶原纤维形成和重塑，另外一种是通过细胞表面整合素受体传递信号来促进细胞粘附、迁移和增殖。目前并没有在人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白中鉴定出POSTN，也未见相关的鉴定方法报道，同时对POSTN的应用研究尚未深入，对于人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN与精原干细胞增殖作用的关系及在临床上男性不育的治疗及男性生育力保存作用方面的研究未见报道。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术提出一种人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN的鉴定和应用，其目的在于提出一种从羊膜间充质干细胞外分泌蛋白中鉴定出POSTN的方法，并验证该蛋白有促进精原干细胞增殖的作用。技术方案：人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN在制备促进精原干细胞增殖制品中的应用。所述制品为药品、保健品和食品。一种人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN的鉴定方法，步骤为：1）人羊膜间充质干细胞条件培养基的收取：在产妇的羊膜组织中提取人羊膜间充质干细胞，对提取的羊膜间充质干细胞进行流式细胞检测；满足阳性率条件后，人羊膜间充质干细胞进行成骨、成脂分化诱导：获得诱导后的人羊膜间充质干细胞；对诱导后的羊膜间充质干细胞采用条件培养基培养，收集条件培养基；2）质谱分析条件培养基中羊膜间充质干细胞外分泌蛋白，筛选出高表达蛋白POSTN。流式细胞检测方法为：将羊膜间充质干细胞在PBS中洗涤2-4次，羊膜间充质细胞悬浮液与FITC-CD73，CD44，CD29，HLA-DR，CD31，CD45的荧光抗体在避光常温孵育20-40分钟，然后PBS洗涤2-4次并重悬，上机测定抗原的阳性率。条件培养基培养方法为：诱导后的人羊膜间充质干细胞培养第二代融合度为80%-90%时传代，分别以2×106-2×108个细胞种至75cm2培养瓶中，24-48小时后用PBS洗2-4次，将培养基换成无血清培养基，24小时收集无血清培养基，-80℃冰箱保存。本专利技术的有益效果及特点：本专利技术鉴定了羊膜间充质干细胞外分泌蛋白组，并对结果进行了分析整合，筛选出精原干细胞增殖积极因子POSTN，对后续羊膜干细胞旁分泌作用的研究提供了详实的基础和新的思路。POSTN为精原干细胞体外增殖提供了新的细胞因子，为更好的挖掘羊膜干细胞外分泌蛋白的特点提供了方向。附图说明图1是羊膜间充质干细胞流式细胞技术鉴定干细胞表面标志物；图2是羊膜间充质干细胞分化潜能的鉴定（成脂、成骨）；图3是ELISA实验验证筛选出羊膜间充质干细胞高表达的外分泌蛋白POSTN、THBS1；图4是MTS证明POSTN促进精原干细胞体外增殖；图5是不同浓度POSTN作用后，EdU染色阳性细胞所占比例。具体实施方式以下结合说明书附图更详细的说明本专利技术。本专利技术是从羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞外分泌蛋白的鉴定入手，借助生物信息学分析，从中筛选出羊膜间充质高表达的外分泌蛋白POSTN。ELISA实验证实筛选结果，利用纯品蛋白刺激精原干细胞，MTS和EDU实验发现该蛋白能有效的促进精原干细胞增殖。本专利技术涉及干细胞与再生医学、蛋白质组在基础医学领域的深入研究与临床的转化应用，重点应用于羊膜干细胞在促进精原干细胞增殖中的积极因子POSTN与男性无精子症临床研究的推广与发展。实施例11.人羊膜间充质干细胞条件培养基的收取材料与方法:蛋白酶抑制剂(碧云天)胰酶（trypsin）BI超滤离心管（MerckMillipore;AmiconUltra-50,Ultracel-3k）BCA试剂盒(碧云天)Ⅳ型胶原酶(sigma)成骨/成脂/成软骨试剂盒(赛业生物)（1）所述羊膜间充质干细胞是由以下方法得到的：取健康剖腹产产妇的羊膜组织，浸泡在生理盐水中30min，用PBS反复冲洗去除粘液。用眼科手术剪将羊膜剪成约1mm×1mm小碎块，加入10ml0.25%trypsin-EDTA，37℃消化30min后加入含血清的培养液，离心去上清，如此反复消化两次，再用PBS洗2-3次，尽可能去除上皮细胞。用细胞筛过滤后剩余的羊膜组织加入IV型胶原酶37℃消化60min，加入含血清的培养液终止消化，混匀后用200目细胞筛过滤，400g离心10min后重悬得到hAMSCs，将细胞接种于DMEM/F12培养基（添加10%胎牛血清和青链霉素）放置于5%CO2的37℃培养箱中培养。（2）对三个不同产妇来源羊膜间充质干细胞进行流式细胞检测：流式细胞仪对第三代羊膜间充质干细胞表面相对特异性抗原进行检测。将羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞在PBS中洗涤三次，羊膜间充质细胞悬浮液与FITC-CD73，CD44，CD29，HLA-DR，CD31，CD45的荧光抗体在避光常温孵育30分钟，然后PBS洗涤三次并重悬。上机测定抗原的阳性率，结果显示CD44、CD73、CD29阳性细胞比例均达99%以上，CD31、CD45、HLA-DR阳性细胞比例均小于1%，见附图1。（3）对三个不同来源人羊膜间充质干细胞进行成骨、成脂分化诱导：对步骤(1)的三个不同来源的羊膜间充质干细胞，分别利用成骨、成脂诱导培养基相应进行成骨、成脂分化，按照试剂盒说明书诱导操作，结果显示hAMSCs在成脂肪细胞分化培养液中诱导3周后，用油红O染色呈红色，表明hAMSCs可以向脂肪细胞方向分化；hAMSCs在成骨诱导后，用茜素红染色呈红色，表明hAMSCs可以向成骨细胞方向分化，见附图2。（4）所述羊膜间充质干细胞条件培养基是由以下方法得到的：羊膜间充质干细胞培养第二代融合度为80%时传代，分别以2x106个细胞种至75cm2培养瓶中。24小时后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN在制备促进精原干细胞增殖制品中的应用。/n

【技术特征摘要】
20210309 CN 20211025757091.人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN在制备促进精原干细胞增殖制品中的应用。


2.根据权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN在制备促进精原干细胞增殖制品中的应用，其特征在于：所述制品为药品、保健品和食品。


3.一种如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN的鉴定方法，其特征在于：步骤为：
1）人羊膜间充质干细胞条件培养基的收取：在产妇的羊膜组织中提取人羊膜间充质干细胞，对提取的羊膜间充质干细胞进行流式细胞检测；满足阳性率条件后，人羊膜间充质干细胞进行成骨、成脂分化诱导：获得诱导后的人羊膜间充质干细胞；对诱导后的羊膜间充质干细胞采用条件培养基培养，收集条件培养基；
2）质谱分析条件培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞希宁，李彩虹，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21