一种快速检测胞内聚羟基脂肪酸酯含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种PHA含量的检测方法，所述的检测方法包括检测PhaP蛋白的表达，计算得到PHA含量。该检测方法快速准确，PhaP蛋白的标记物荧光蛋白的荧光强度可以即时检测获取，从而计算得到PHA含量；检测范围广泛，能够对多种PHA类物质进行含量检测，不仅适用于于天然的PHA生产菌株中，还能够迁移到非天然的PHA生产菌株中使用；检测成本价格低廉，采用分光光度计得到FI和OD

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测胞内聚羟基脂肪酸酯含量的方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种聚羟基脂肪酸酯（PHA）含量的检测方法。
技术介绍
PHA是生物细胞内一类具有相似结构的功能性聚酯，作为能源储备物质广泛存在于微生物的细胞中。由于PHA的力学性质和热塑性质与聚乙烯、聚丙乙烯具有相似性，因而可以开发利用为高分子材料。除此之外，PHA还具有生物可降解性和生物相容性，因而被认为是一种环境友好型生物基高分子材料，在包装产业、有机农业、医学材料以及先进传感器研发方面具有重要的应用前景。根据PHA侧链的长短不同，可将PHA分为三种类型：(1)短链PHA，如聚羟基丁酸酯（PHB）、羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物（PHBV），单体含3-5个碳原子。(2)中长链PHA，如聚羟基己酸酯（PHHx）、聚羟基辛酸酯（PHO），单体含6个以上碳原子。(3)含短链与中长链单体的PHA，多是两种或两种以上单体的随机共聚物。PHA颗粒表面结合蛋白PhaP（以下简称PhaP）广泛存在于各种PHA合成菌中，用于胞内PHA颗粒的包裹，并且PhaP蛋白的表达量受到PHA合成的调控，是PHA合成量的天然指示。虽然PhaP蛋白不是PHA合成所必需的，但会直接影响PHA包含体颗粒的尺寸大小和PHA合成积累的速率，在某些菌种中，如Ralstoniaeutropha中，PhaP1的量受到调控且能够正比于胞内PHA的含量。PHA由微生物菌种发酵获得，目前工业级的PHA生产高度依赖高效产PHA的微生物菌种，其胞内PHA的含量是衡量发酵质量的重要指标，高含量的PHA不仅证明发酵质量良好，且降低了下游提取PHA的难度。气相色谱检测法是检测PHA的标准方法，通过该方法可以准确的获知胞内PHA含量和组成，但是过程繁琐且会产生含有有机氯的废液，不利于环境保护。在气相色谱分析法下，菌体首先要进行离心，洗涤并冷冻干燥，将干燥后的菌体称重后，再和甲醇-氯仿在酸性环境下100℃反应4小时左右，再经过萃取除去甲醇后，将有机相进入气相色谱仪进行分析（Braunegg等,EuropeanJournalofAppliedMicrobiologyandBiotechnology.,6(1978)29-37）。气相色谱分析法对于分析PHA生产而言，耗时长且无法对发酵中的样品中的PHA含量进行实时监测并指导发酵策略的调整，不适应大规模快速生产实时定量的需要。尼罗红荧光技术是另一种定量检测PHB的方法（Degelau等,AppliedMicrobiologyandBiotechnology.,42(1995)653-657）。尼罗红很容易在悬浮液中穿透细胞，短时间内即可对胞内PHB含量进行检测，经尼罗红染色后的细胞的荧光强度与PHB浓度呈正相关关系。但是，该方法的敏感度低，特别是在菌种发酵PHB的初始阶段，发酵菌株还未积累足够量的PHB，可能会出现染色不够彻底的情况，且对染色条件有较强的依赖性，容易出现假阳性等情况。现有技术中，对PHA含量的测定一直采用耗时昂贵或精确度比较低的方法。气相色谱检测法中，对样品的提取较为费时费力，需要较长时间的样品前处理过程，对操作人员的熟练程度也有较高的要求，从细胞中提取得到的PHA必须用氯仿处理一段时间，这一过程产生的含有有机氯的废液，还会对环境造成污染；尼罗红荧光技术敏感度低，特别是在菌种发酵PHA的初始阶段，发酵菌株还未积累足够量的PHA，可能会出现染色不够彻底的情况，导致检测结果不够精确。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术人通过大量的实验，提供了一种PHA含量的检测方法。该检测方法快速准确、成本低廉，且能够实时定量测定发酵罐中菌株生产的PHA。本专利技术提供了一种PHA含量的检测方法，所述的检测方法包括检测PhaP蛋白的表达，计算得到PHA含量。进一步地，所述的检测PhaP蛋白的表达包括通过检测标记物得到PhaP蛋白的表达量。进一步地，所述的检测PhaP蛋白的表达包括将编码标记物的基因与编码PhaP蛋白的基因融合表达后，通过检测标记物得到PhaP蛋白的表达量。进一步地，所述的标记物选自荧光蛋白、荧光色素、荧光探针、荧光微球和稀土荧光配合物中的一种，优选地，所述的标记物为荧光蛋白。进一步地，所述的荧光蛋白选自绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP和黄色荧光蛋白YFP中的一种。进一步地，所述的编码PhaP蛋白的基因与编码荧光蛋白的基因融合表达，通过检测所述荧光蛋白的荧光强度，得到PhaP蛋白的表达量。进一步地，所述的检测方法能应用于生产PHA的微生物中。进一步地，所述的生产PHA的微生物为天然的PHA生产菌株及其突变体或非天然的PHA生产菌株，优选的，天然的PHA生产菌株及其突变体选自Ralstoniaeutropha，Halomonasbluephagenesis和Halomonascampaniensis，非天然的PHA生产菌株选自搭建了PHA生产系统的异源菌株，优选的，异源菌株为Escherichiacoli。进一步地，所述的PhaP蛋白为天然的或修饰后的PhaP蛋白，选自PhaP1或PhaP2。进一步地，所述的PhaP1蛋白选自Ralstoniaeutropha、Halomonasbluephagenesis和Halomonascampaniensis中的一种。进一步地，所述的PhaP2蛋白选自Halomonasbluephagenesis或Halomonascampaniensis进一步地，所述的PHA为天然或非天然聚羟基脂肪酸酯，所述的天然或非天然聚酯包括聚3-羟基丁酸酯（PHB）、3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯（P3HB-co-4HB）、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚酯（P3HB-co-3HHx）、羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物（PHBV）、聚羟基己酸酯（PHHx）和聚羟基辛酸酯（PHO）。进一步地，所述的标记物的检测方法包括荧光分光光度法、紫外分光光度法、流式细胞仪荧光分析法、显微荧光定量法（荧光显微镜分析法、荧光共聚焦显微镜分析法）、全内反射荧光分析法和双光子荧光分析法，优选地，所述的标记物的检测方法为荧光分光光度法、紫外分光光度法和流式细胞仪荧光分析法中的一种或两种以上的组合。进一步地，所述的编码PhaP蛋白的基因与编码荧光蛋白的基因融合表达的具体步骤为：（1）、构建质粒：在phaP蛋白基因的下游非编码区设计向导RNA，然后通过Gibson法将表达荧光蛋白的基因片段gfp或rfp或yfp与pSEVA341骨架、向导RNA和上下游同源臂连接，构建质粒；（2）、细菌接合实现基因编辑：首先将包含有Cas9蛋白的质粒（氯霉素抗性）接合转移到生产PHA的细菌中，然后将步骤（1）所得质粒也接合转移到这个菌中，再通过包含氯霉素和壮观霉素的平板筛选同时含有Cas9蛋白和同源臂质粒的菌，通过phaP蛋白基因上下游的引物验证是否基因编辑成功，最后将基因编辑成功的细菌在没有抗性的培养基中传代培养至质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括检测PhaP蛋白的表/n达，计算得到PHA含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括检测PhaP蛋白的表
达，计算得到PHA含量。


2.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的检测PhaP蛋白的表达包括通过检测标记物得到PhaP蛋白的表达量。


3.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的检测PhaP蛋白的表达包括将编码标记物的基因与编码PhaP蛋白的基因融合表达后，通过检测标记物得到PhaP蛋白的表达量。


4.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的标记物选自荧光蛋白、荧光色素、荧光探针、荧光微球和稀土荧光配合物中的一种。


5.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的标记物为荧光蛋白。


6.根据权利要求4所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的荧光蛋白选自绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP和黄色荧光蛋白YFP中的一种。


7.根据权利要求4所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的编码PhaP蛋白的基因与编码荧光蛋白的基因融合表达后，通过检测所述荧光蛋白的荧光强度，得到PhaP蛋白的表达量。


8.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的检测方法能应用于生产PHA的微生物中。


9.根据权利要求8所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的生产PHA的微生物为天然的PHA生产菌株及其突变体或非天然的PHA生产菌株。


10.根据权利要求9所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的天然的PHA生产菌株及其突变体选自Ralstoniaeutropha，Halomonasbluephagenesis和Halomonascampaniensis；所述的非天然的PHA生产菌株选自搭建了PHA生产系统的异源菌株。


11.根据权利要求9所述的一种PHA含量的检测方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国强，刘絮，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11