一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。利用oxyethyleneglycol bridge修饰引物通过PCR扩增获得的5’端带有粘性末端的扩增子，以此为模板实现双链功能核酸纳米花的组装，且通过核酸定量分析方法，计算发现纳米花对双链核酸的装载率高达86%‑98%；进而通过调节双链功能核酸纯化子浓度、Mg

【技术实现步骤摘要】
一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用
本专利技术属于生物纳米材料领域，具体涉及一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。
技术介绍
核酸特有的沃森-克里克碱基配对特性，使其可作为构建各种纳米结构的元件。相比于传统纳米材料，核酸纳米材料具有序列可编程性、自动控制合成、稳定性高以及其本身的功能，从而广泛用于生物医疗、生物技术和纳米电化学中。常见的核酸纳米结构如多面体、核酸纳米粒子、核酸纳米管、DNA折纸等，这些构建核酸纳米结构的方法均依赖于短的核酸链之间的沃森-克里克碱基配对，然而，这些方法也存在一些缺点，如需要对核酸链进行复杂的设计，需制备大量的核酸链，核酸链间的空间位阻导致其结构不紧密，切口的存在使其易被核酸酶降解，变性等条件会导致其结构的解离从而破坏纳米结构的完整性。因此，需要一种不依赖于沃森-克里克碱基配对作用，只需少量的不含有切口的核酸链来构建堆积紧密、多功能化的核酸纳米结构。DNA纳米花是一种紧密堆积的非典型的层级的自组装结构，不依赖于沃森-克里克碱基配对，在无机焦磷酸镁的存在下，利用DNA链与焦磷酸镁之间的相互作用，通过DNA液体结晶化、各向异性的有序组装而形成高浓度的多聚体。紧密堆积的DNA纳米花可用于装载各种功能基团，如药物和成像物质等，纳米花的形貌大小对于其应用具有重要作用。因此，对于纳米花形貌的调控的研究十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。为了实现本专利技术的目的，利用oxyethyleneglycolbridge修饰引物通过PCR扩增获得的5’端带有粘性末端的扩增子，以此为模板实现双链功能核酸纳米花的组装，且通过核酸定量分析方法，计算发现纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%；进而通过调节双链功能核酸扩增子浓度、Mg2+浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控。此外，利用功能核酸纳米花优良的比表面积和核酸特异性，实现了功能核酸纳米花高效捕获单链核酸靶标。第一方面，本专利技术提供一种双链功能核酸纳米花的组装方法，用化学修饰的核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，对所述PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板进行双链功能核酸纳米花的组装；所述的化学修饰的核酸引物为上游引物1SEQIDNO:1（序列中n代表oxyethyleneglycolbridge）和下游引物1SEQIDNO:2（序列中n代表oxyethyleneglycolbridge）；具体的，上游引物SEQIDNO:1：5’-GGGGGGAAGAGGGAAGGTT-oxyethyleneglycolbridge-TTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’；具体的，下游引物SEQIDNO:2：5’-GGGGGGAAGAGGGAAGGTT-oxyethyleneglycolbridge-TTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’；所述的化学修饰为oxyethyleneglycolbridge，具体结构为：所述纯化方法为去除PCR扩增体系中的蛋白质、盐等非PCR产物；优选地，纯化方法采用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒(DP204-02)对扩增产物进行纯化；所述纯化子孵育是在30℃的金属浴中孵育18h进行高效组装，其中孵育体系是159μLddH2O,20μL10×PCRBuffer(Mg2+plus)，17μLMg2+(100mM),2μLPPi(100mM)，2μLPCR纯化子。随后，使用冷冻离心机于4℃下12000rpm/min离心30min，弃上清；加入20μL去离子水充分洗涤，于4℃下12000rpm/min离心30min，弃上清，用去离子水以上述方法洗涤两次后晾干过夜，通过扫描电镜观察双链功能核酸纳米花的形貌。第二方面，本专利技术利用双链功能核酸纳米花对Tris-HClbuffer(pH5.0)不耐受，将制备好的纳米花样品使用Tris-HClbuffer(pH5.0)中进行溶解，建立双链功能核酸纳米花的核酸定量分析方法；所述定量分析方法，首先使用10倍梯度稀释的纯化PCR扩增子(浓度为95.218ng/μL)为扩增模板，进行realtimePCR的定量分析,SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)(FP205天根生化科技(北京)有限公司)，PCR过程选用了25μL的PCR扩增体系，组分如下：其中，使用的上游引物2SEQIDNO:3与下游引物2SEQIDNO:4的序列分别为：上游引物SEQIDNO:3：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’下游引物SEQIDNO:4：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’实验得到的realtimePCR的扩增曲线，并依据其Ct值与扩增模板的浓度之间的线性关系绘制出标准曲线：y=-4.553x+16.507。标准曲线绘制完毕后，即可定量分析纳米花对双链核酸的装载率。该过程使用双链功能核酸纳米花的Tris-HClbuffer(0.05mM,pH5.0)溶解物的10倍梯度稀释产物作为realtimePCR的扩增模板，使用上游引物SEQIDNO:3与下游引物SEQIDNO:4作为realtimePCR的扩增引物(PCR扩增体系同上)，进行realtimePCR。通过测定的Ct值，带入上述标准曲线，计算得到双链功能核酸的浓度，进而计算得到纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%。第三方面，本专利技术提供一种双链功能核酸纳米花的形貌调控方法，用化学修饰的核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，用所述PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板通过调控纯化子浓度、Mg2+浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控；所述纯化子的浓度范围在1.00pg/L~200μg/L；具体地，能够显著调控双链功能核酸纳米花的形貌的纯化子浓度为：95.218pg/L~95.218μg/L；所述Mg2+浓度范围在0.10~20mM；具体地，能够显著调控双链功能核酸纳米花的形貌的Mg2+浓度为：2.5~10mM；所述焦磷酸根浓度范围在0.01~5.00mM；具体地，能够显著调控双链功能核酸纳米花的形貌的焦磷酸根浓度为：0.25~1.0mM。第四方面，本专利技术提供一种双链功能核酸纳米花的应用，将预先合成的双链功能核酸纳米花喷涂在硝酸纤维素膜上，然后通过侧流层析作用捕获特定的单链核酸；所述单链核酸通过羧氨反应偶联标记在磁珠上；具体的，氨基修饰的核酸序列，其序列如SEQIDNO:5所示，具体为：5’-GGGGGGAAGAGGGAAGGGGTGGTGGGTTTT-NH2-3’。所述捕获方法是通过观察硝酸纤维素膜上是否有棕色的条带，判断功能核酸纳米花捕获磁珠偶联的单链核酸。另一方面，本专利技术的双链功能核酸纳米花的组装和形本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双链功能核酸纳米花的组装方法，其特征在于：用化学修饰的核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，对所述PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板进行双链功能核酸纳米花的组装；/n所述双链功能核酸纳米花的组装是在20~40℃的金属浴中孵育15 h以上，其中孵育体系是1×PCR Buffer (Mg

【技术特征摘要】
1.一种双链功能核酸纳米花的组装方法，其特征在于：用化学修饰的核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，对所述PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板进行双链功能核酸纳米花的组装；
所述双链功能核酸纳米花的组装是在20~40℃的金属浴中孵育15h以上，其中孵育体系是1×PCRBuffer(Mg2+plus)，5~15μMMg2+,0.25~5.00μMPPi，10~500ng/μLPCR纯化子，加入ddH2O补齐至200μL。


2.如权利要求1所述的双链功能核酸纳米花的组装方法，其特征在于：利用双链功能核酸纳米花对Tris-HClbufferpH5.0不耐受，将制备好的纳米花样品使用Tris-HClbufferpH5.0中进行溶解，建立双链功能核酸纳米花的核酸定量分析方法；所述纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%。


3.一种双链功能核酸纳米花的形貌调控方法，其特征在于：用化学修饰的核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，用所述PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板通过调控纯化子浓度、Mg2+浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控；
所述纯化子的浓度范围在1.00pg/L~200μg/L；
所述Mg2+浓度范围在0.10~20mM；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，田晶晶，贺晓云，朱龙佼，朱丽叶，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11