一种糖尿病肾病趋化因子检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种糖尿病肾病趋化因子检测试剂盒及其应用，属于生物医学领域。一种试剂盒，包括：第一上下游引物与第一探针，第一上下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1～2所示，第一探针序列为SEQ ID NO.3所示；第二上下游引物与第二探针，第二上下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.4～5所示，第二探针序列为SEQ ID NO.6所示；以及第三上下游引物与第三探针，第三上下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.7～8所示，第三探针序列为SEQ ID NO.9所示。

【技术实现步骤摘要】
一种糖尿病肾病趋化因子检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种糖尿病肾病趋化因子检测试剂盒及其应用。
技术介绍
糖尿病肾病是糖尿病最常见的慢性并发症，肾小球滤过率下降和尿白蛋白水平升高是糖尿病肾病主要的临床特征和诊断依据，肾活检病理是糖尿病肾病诊断的金标准，其中肾间质纤维化是反映疾病进展最重要的组织病理学指标。然而，由于肾脏有较强的代偿能力，肾小球滤过率的下降不能反映糖尿病肾病的早期改变。尿白蛋白的检测受到诸多因素影响，且主要反映肾小球损害，不能反映肾间质纤维化程度。肾活检为创伤性检查，可引起出血等并发症，不宜用于广泛筛查及长期监测。因此，寻找体液中反映糖尿病肾病进展的指标分子，对疾病的预后评估和优化治疗方案具有重要意义。信使核糖核酸(mRNA)由DNA的一条链作为模板转录而来、指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。已有研究证明，在糖尿病肾病中尿液脱落细胞中，有多种mRNA分子如足细胞标记蛋白的表达水平发生改变。慢性炎症是糖尿病肾病进展的重要机制，而趋化因子具有募集巨噬细胞、T细胞等作用，与糖尿病肾病肾间质炎症和纤维化关系非常密切。然而，糖尿病肾病尿液脱落细胞中趋化因子的改变及其与肾间质纤维化的关系，尚缺乏充分的研究依据。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术采用生物信息学筛选结合临床验证，发现糖尿病肾病患者中尿液脱落细胞趋化因子CCL5和CXCL1表达升高，且能够提示肾间质纤维化，故提出一种糖尿病肾病趋化因子检测试剂盒及其应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种试剂盒，包括：第一上下游引物与第一探针(NCBIBLASTAccession:NM_002985.3)，上下游引物核苷酸序列为SEQIDNO.1～2所示，所述第一探针序列为SEQIDNO.3所示；第二上下游引物与第二探针(NCBIBLASTAccession:NM_001511.4)，上下游引物核苷酸序列为SEQIDNO.4～5所示，所述第二探针序列为SEQIDNO.6所示；以及第三上下游引物与第三探针(NCBIBLASTAccession:NM_004048.4)，上下游引物核苷酸序列为SEQIDNO.7～8所示，所述第三探针序列为SEQIDNO.9所示。可选地，第一探针、第二探针与第三探针连接的荧光基团为FAM-BHQ1。可选地，所述第一探针、第二探针与第三探针标记的荧光报告基团是FAM，3’端连接淬灭基团。可选地，所述淬灭基团为BHQ1非荧光淬灭基团。上述的试剂盒在检测趋化因子CCL5和/或CXCL1中的应用。可选地，所述试剂盒的PCR反应体系中，提取的样本RNA、上下游引物和探针混合液、MasterMix与PCR酶混合液的体积比为1：3.5：0.5：5。可选地，执行检测时的反应条件为42℃5min；95℃10min；95℃20s；60℃退火/延伸45s，循环45次；40℃冷却30s。附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。图1本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测CCL5和CXCL1两种mRNA在糖尿病肾病患者及对照组尿液中的差异表达，即不同人群中尿脱落细胞mRNA相对表达水平的差异；其中，Control：健康人，T2DM：2型糖尿病，DN：糖尿病肾病；图2本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测不同病理损害程度的糖尿病肾病患者尿液CCL5和CXCL1mRNA的表达差异，或者说糖尿病肾病患者尿液CCL5和CXCL1mRNA的表达水平及与肾间质纤维化的关系；其中，(a)糖尿病肾病组织过碘酸-雪夫染色，显示肾小球病变。(b)糖尿病肾病组织马松三色染色，显示肾间质纤维化。(c)不同Tervaert肾小球病变分期患者尿CCL5mRNA水平的比较。(d)不同肾间质纤维化程度患者尿CCL5mRNA水平的比较。(e)根据Tervaert分期，不同阶段肾小球病变尿液CXCL1mRNA水平。(f)不同程度肾间质纤维化患者尿CXCL1mRNA表达水平。*P<0.05。Stage:分期；mild:轻度；moderate：中度；severe：重度；RIF:肾间质纤维化；半定量法分为轻度(小于25％间质纤维化)、中度(大于25％小于50％间质纤维化)和重度(大于50％间质纤维化)。图3本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测内参基因B2M的扩增曲线；图4本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测CCL5的扩增曲线；图5本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测CXCL1的扩增曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术的一些示例中，公开了一种基于Taqman探针的糖尿病肾病相关趋化因子检测荧光定量PCR试剂盒，包括检测CCL5基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO1-3所示；检测CXCL1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO4-6所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO7-9所示。序列SEQIDNO如下表1所示：表1引物序列和探针序列试剂盒中还包括所述PCR试剂盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。PCR酶混合液为m-mlv逆转录酶和RNaseinhibitor混合液。试剂盒中配置好上下游引物和探针混合液、PCR酶混合液和MasterMix。其中，上下游引物和探针混合液中上下游引物浓度为0.6uM～1.5uM，探针浓度为0.3uM～1uM；PCR酶混合液中m-mlv逆转录酶浓度为200～3000U/ul,RNaseinhibitor浓度为40～1200U/ul；MasterMix包含浓度为75mM～125mM的KCl，浓度为4mM～8mM的MgCl2，浓度为20mM～100mM、pH为7.9～8.3的Tris-HCl，浓度为0.2uM～0.8uM的dNTPs，浓度为0.02U～0.1U/ul的热启动Taq酶，以及适量的PCR增强剂。PCR反应体系为10ul，包括提取的样本RNA1ul，上下游引物和探针混合液3.5ul，PCR酶混合液0.5ul，MasterMix5ul。荧光定量PCR反应条件为：42℃5min；95℃10min；95℃20s；60℃退火/延伸45s，循环45次；40℃冷却30s。实施例2样本：选取经肾活检确诊的糖尿病肾病91例为实验组，糖尿病不合并肾损害者60例、61例健康体检者的尿液样本为对照组。尿沉渣RNA提取：将留取的晨尿3000g离心30min得到尿沉渣，参照Takara公司RNA提取操作流程提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计检测RNA纯度(A260/A280)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂盒，其特征在于，包括：/n第一上下游引物与第一探针，上下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1～2所示，所述第一探针序列为SEQ ID NO.3所示；/n第二上下游引物与第二探针，上下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.4～5所示，所述第二探针序列为SEQ ID NO.6所示；以及/n第三上下游引物与第三探针，上下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.7～8所示，所述第三探针序列为SEQ ID NO.9所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，包括：
第一上下游引物与第一探针，上下游引物核苷酸序列为SEQIDNO.1～2所示，所述第一探针序列为SEQIDNO.3所示；
第二上下游引物与第二探针，上下游引物核苷酸序列为SEQIDNO.4～5所示，所述第二探针序列为SEQIDNO.6所示；以及
第三上下游引物与第三探针，上下游引物核苷酸序列为SEQIDNO.7～8所示，所述第三探针序列为SEQIDNO.9所示。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，第一探针、第二探针与第三探针连接的荧光基团为FAM-BHQ1。


4.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘必成，冯松涛，雷向东，
申请(专利权)人：东南大学，上海境象生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32