高通量测序检测人源DNA的IGH免疫组库的引物组和方法技术

本发明专利技术公开了一种基因高通量测序检测人源DNA的IGH免疫组库的引物组和检测方法。引物组由多组合计21条引物组成，检测方法包括以下步骤：(1)以全血基因组或淋巴细胞基因组为模板，采用3组引物分别进行多重PCR扩增，等体积混合后回收扩增产物；(3)回收产物通过接头连接法构建扩增子DNA文库，并回收文库；(4)通过高通量测序仪进行文库测序。本发明专利技术提供的引物组和检测方法并以此获得的高通量测序结果能应用于包括但不限于健康人群免疫状态评估、B淋巴细胞相关恶性肿瘤的MRD监测等方面，具有灵敏度高、可重复性高，准确度高等优势。

【技术实现步骤摘要】
高通量测序检测人源DNA的IGH免疫组库的引物组和方法
本专利技术涉及DNA测序
，具体涉及高通量测序检测人源DNA的IGH免疫组库的引物组和方法。
技术介绍
B细胞受体(BCR)是一种位于B细胞表面的负责特异性识别及结合抗原的免疫球蛋白。BCR由两条重链(IGH基因编码)和两条轻链(IGK、IGL基因编码)组成。每条肽链的互补决定区(尤其是CDR3)的多样性决定了抗原的特异结合的特异性和多样性，而其中重链IGH的多样性表现最为丰富。CDR3由三组片段组成：V/D/J片段，在B细胞成熟过程中V/D/J片段会发生重组，同时在重组过程中伴随随机碱基的插入缺失等，最终形成大量的不同组合和长度的CDR3序列，构成复杂庞大的BCR(IGH)免疫组库。健康人群BCR基因重组呈现随机分布，外周B淋巴细胞呈多家族、多克隆性。在受到来自肿瘤细胞、疫苗、病原微生物或者移植物等抗原刺激后，BCR的CDR3区可对该抗原产生特异性免疫应答，使带有这类重组组合的B淋巴细胞得到优势增殖，出现优势克隆。随着胸腺再生，大量原始B淋巴细胞增殖，免疫组库多样性得到恢复和重建，因此BCR免疫组库代表着体内的免疫反应状态。BCR免疫组库检测可应用于疫苗和医药的研发、生物标志物的发现、B淋系疾病微小残留病(minimalresidualdisease，MRD)检测、自身免疫性疾病的研究以及等领域，具有良好的科研和临床应用价值。本项目建立以多重PCR和高通量测序技术为基础的检测DNA样本BCR(IGH)的CDR3区域重组多态性的检测体系，提供临床科研服务及临床应用。因此，专利技术高通量测序检测人源DNA的IGH免疫组库的引物组和方法很有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立以多重PCR和高通量测序技术为基础的检测DNA样本BCR(IGH)的CDR3区域重组多态性的检测体系及其专用引物组。高通量测序检测人源DNA的IGH免疫组库的引物组，包括引物组1、引物组2和引物组3，引物组1由如下7条引物组成：引物1为表1的引物1所示的单链DNA分子；引物2为表1的引物2所示的单链DNA分子；引物3为表1的引物3所示的单链DNA分子；引物4为表1的引物4所示的单链DNA分子；引物5为表1的引物5所示的单链DNA分子；引物6为表1的引物6所示的单链DNA分子；引物21为表1的引物21所示的单链DNA分子；引物组2由如下8条引物组成：引物7为表2的引物7所示的单链DNA分子；引物8为表2的引物8所示的单链DNA分子；引物9为表2的引物9所示的单链DNA分子；引物10为表2的引物10所示的单链DNA分子；引物11为表2的引物11所示的单链DNA分子；引物12为表2的引物12所示的单链DNA分子；引物13为表2的引物13所示的单链DNA分子；引物21为表2的引物21所示的单链DNA分子；引物组3由如下8条引物组成：引物14为表3的引物14所示的单链DNA分子；引物15为表3的引物15所示的单链DNA分子；引物16为表3的引物16所示的单链DNA分子；引物17为表3的引物17所示的单链DNA分子；引物18为表3的引物18所示的单链DNA分子；引物19为表3的引物19所示的单链DNA分子；引物20为表3的引物20所示的单链DNA分子；引物21为表3的引物21所示的单链DNA分子；高通量测序检测人源DNA的IGH免疫组库的方法包括如下步骤：a)以待测样本的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物组进行PCR扩增，等体积混合后回收扩增产物；b)以扩增产物为模板，采用连接法将测序接头连接到PCR产物两端，回收连接产物，即为DNA文库；c)将DNA文库进行高通量测序，获得IGH免疫组库。附图说明图1为样本M01的CDR3长度分布，图2为样本M01的D基因长度分布，图3为样本M01的J基因利用率，图4为样本M01的V基因利用率，图5为样本M01的VJ基因利用率，图6为样本M02的CDR3长度分布，图7为样本M02的D基因长度分布，图8为样本M02的J基因利用率，图9为样本M02的V基因利用率，图10为样本M02的VJ基因利用率。具体实施方式用三组IGH特异性引物进行多重PCR扩增获得IGH基因CDR3区域，构建扩增子文库，在IlluminaNextSeq测序平台进行测序。对测序结果过滤后组装比对，并对组库结构以及多样性进行评估，对优势克隆进行追踪分析，具体步骤如下。1.IGH引物组合与分孔方案引物组目标扩增区域包含人DNA中编码BCR重链(IGH)中的V区部分、整个D区和J区部分，引物母液使用TEBuffer(Invitrogen，货号12090015)进行稀释，母液浓度均为100uM，工作液中每条引物浓度2.5uM，工作液primerMix配置方案：每tube中各引物母液分别取1ul，最终使用ΜltraPureTMDNase/RNase-FreeDistilledWater(Invitrogen，货号10977-015)补足至40ul，最终形成IGH-tubeA/IGH-tubeB/IGH-tubeC共计3个引物tubes。表1.IGHtubeA引物序列表表2.IGHtubeB引物序列表表3.IGHtubeC引物序列表2.获取质量合格DNA样本DNA样本浓度要求大于45ng/ul，纯度要求260/280位于1.5到2.0之间，体积大于100ul；或DNA总量大于4.5ug。将DNA母液稀释成45ng/ul工作液。3.多重PCR取0.2ml离心管，按表4配置反应体系，其中组分1、组分3、组分4采用LAmpDNAPolymerase(Mg2+plusbuffer)-vazyme，货号P301中的试剂，组分2采用dNTPMix(2.5mMeach)-vazyme，货号P032-02，组分6采用步骤2中稀释后的DNA工作液，组分7采用步骤1中稀释后的引物工作液PrimerMix，每个样本包含3组引物反应，多重PCR反应液配置完成后置于PCR仪中根据表5进行扩增。表4.PCR扩增组分表序号组分体积(ul)组分110×VazymeLAmpBuffer(Mg2+plus)2组分2dNTPMix(2.5mMeach)1.6组分35×PCREnhancer2.5组分4VazymeLAmpDNAPolymerase(5U/ul)0.15组分5ddH2O1.75组分6DNA(45ng/ul)10组分7IGH-A/IGH-B/IGH-C(2.5uM)2表5.PCR扩增程序表4.扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高通量测序检测人源DNA的IGH免疫组库的引物组，其特征在于，包括引物组1、引物组2和引物组3，所述引物组1由如下7条引物组成：引物1为表1的引物1所示的单链DNA分子；引物2为表1的引物2所示的单链DNA分子；引物3为表1的引物3所示的单链DNA分子；引物4为表1的引物4所示的单链DNA分子；引物5为表1的引物5所示的单链DNA分子；引物6为表1的引物6所示的单链DNA分子；引物21为表1的引物21所示的单链DNA分子；所述引物组2，由如下8条引物组成：引物7为表2的引物7所示的单链DNA分子；引物8为表2的引物8所示的单链DNA分子；引物9为表2的引物9所示的单链DNA分子；引物10为表2的引物10所示的单链DNA分子；引物11为表2的引物11所示的单链DNA分子；引物12为表2的引物12所示的单链DNA分子；引物13为表2的引物13所示的单链DNA分子；引物21为表2的引物21所示的单链DNA分子；所述引物组3，由如下8条引物组成：引物14为表3的引物14所示的单链DNA分子；引物15为表3的引物15所示的单链DNA分子；引物16为表3的引物16所示的单链DNA分子；引物17为表3的引物17所示的单链DNA分子；引物18为表3的引物18所示的单链DNA分子；引物19为表3的引物19所示的单链DNA分子；引物20为表3的引物20所示的单链DNA分子；引物21为表3的引物21所示的单链DNA分子；/n...

【技术特征摘要】
1.高通量测序检测人源DNA的IGH免疫组库的引物组，其特征在于，包括引物组1、引物组2和引物组3，所述引物组1由如下7条引物组成：引物1为表1的引物1所示的单链DNA分子；引物2为表1的引物2所示的单链DNA分子；引物3为表1的引物3所示的单链DNA分子；引物4为表1的引物4所示的单链DNA分子；引物5为表1的引物5所示的单链DNA分子；引物6为表1的引物6所示的单链DNA分子；引物21为表1的引物21所示的单链DNA分子；所述引物组2，由如下8条引物组成：引物7为表2的引物7所示的单链DNA分子；引物8为表2的引物8所示的单链DNA分子；引物9为表2的引物9所示的单链DNA分子；引物10为表2的引物10所示的单链DNA分子；引物11为表2的引物11所示的单链DNA分子；引物12为表2的引物12所示的单链DNA分子；引物13为表2的引物13所示的单链DNA分子；引物21为表2的引物21...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仲征，方罡，李岱阳，徐祥，袁志阳，
申请(专利权)人：深圳荻硕贝肯精准医学有限公司，上海荻硕贝肯医学检验所有限公司，上海荻硕贝肯生物科技有限公司，上海荻硕贝肯基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44