一种用于单细胞测序的具有特定寡核苷酸序列的微球制造技术

本发明专利技术属于单细胞测序相关试剂，具体涉及一种具有特定寡核苷酸序列的聚丙烯酰胺微球及其制备方法。本发明专利技术以聚丙烯酰胺微球为寡核苷酸序列分子标签的基底，利用化学键和酶连接的方法将三段寡核苷酸(oligo)按顺序连接到聚丙烯酰胺微球上，合成为带有独特oligo序列的聚丙烯酰胺微球。本发明专利技术聚丙烯酰胺微球具有特定的核苷酸序列，体积较大，根据市场上常用微流控芯片流道尺寸定制，又由于聚丙烯酰胺微球质地稍软、微弹，在实际使用中可单独占满一条流道并排列整齐，明显降低液滴包裹单个微球的难度和批次差异，使得该微球比传统硬质小微球更适用于基于液滴微流控的单细胞测序，提高单细胞测序结果的稳定性和精确性，可以广泛的应用于医学、生物等研究。

【技术实现步骤摘要】
一种用于单细胞测序的具有特定寡核苷酸序列的微球
本专利技术属于单细胞测序试剂，具体涉及一种具有特定寡核苷酸序列的聚丙烯酰胺微球。
技术介绍
单细胞测序(single-cellRNA-sequencing，scRNA-seq)是近几年兴起的新技术，它能够从单个细胞水平获得全转录组表达谱、扩增后进行高通量测序，从而高效地检测单个细胞内的基因表达水平，在肿瘤的诊断与治疗、靶向药物的设计、干细胞的发育与分化等领域具有重要的应用价值。单细胞转录组测序之所以可以同时对成百数千个细胞进行测序，是因为每个细胞都贴有不同的标签，为了区别每个细胞中的每条mRNA，每条mRNA同样被赋予一个唯一的分子标签。目前单细胞测序的微流控平台，主要是将单个细胞与带有分子标签和细胞标签的单个微球置于一个微孔环境，细胞裂解后，不同的细胞可携带特异的细胞标签，经反转录同一个细胞的不同mRNA又被不同分子标签所标记。这种方法可追踪每个基因的细胞来源，而且可以对mRNA进行定量，显著提高了测序通量、降低测序成本并且减轻扩增偏好的影响。但是目前存在最新的基于液滴微流控技术的单细胞测序，可以将复杂的多个步骤集成与一个微流控芯片上，而传统的带有分子标签的微球均存在制作成本高、制备困难、制备成功率低、以及不同批次效果不稳定等诸多问题，最严重的是液滴微流控技术难以对传统微球形成单包裹，影响单细胞测序结果的稳定性和精确性，同时这也是的单细胞测序费用昂贵，不能广泛应用的原因之一。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，目的在于提供一种大体积非硬质的具有特定寡核苷酸序列的聚丙烯酰胺微球，聚丙烯酰胺微球上装配有固定类型的分子标签序列，其制备工艺简单、批间差异小，错误率低、成本低廉。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的实施例公开了一种大体积非硬质的具有寡核苷酸序列的聚丙烯酰胺微球。所述的聚丙烯酰胺微球表面依次修饰链接有三段或以上种寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列包含三段,D1、D2和D3。D1的顺序为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT【X】A；D2的顺序为CTG【Y】A，D3的顺序为CTG【Z】【polyT】。其中X、Y、Z分别代表4-14bp长的DNA序列，polyT代表10-35个T。利用化学键和DNA连接酶或聚合酶将三段连接起来,连接到聚丙烯酰胺微球上，合成为带有oligo序列的聚丙烯酰胺微球。所述聚丙烯酰胺微球还含有辅助序列RC2、RC3；RC2为ACTG【Y】ACTG的互补序列，RC3位【Z】【polyT】的互补序列。进一步地，X代表6-12bp长的任意DNA序列；进一步地，Y代表6-12bp长的任意DNA序列；进一步地，Z代表6-12bp长的任意DNA序列。进一步地，polyT代表15-25个T。本专利技术还提供了一种具有特定寡核苷酸序列的微球的合成方法，所述方法包括如下步骤：(1)分别合成三段寡核苷酸序列D1、D2、D3和对应的辅助序列RC2、RC3；(2)将寡核苷酸序列D1、聚丙烯酰胺微球单体和引发剂，通过微流控技术制备聚丙烯酰胺微球，得到与D1连接的聚丙烯酰胺微球混合物A；(3)在步骤(2)所得的聚丙烯酰胺微球混合物A中加入DNA连接酶得到混合体系M；将寡核苷酸序列D2、辅助序列RC2与混合体系M混合，得到与D1和D2连接的聚丙烯酰胺微球混合物B；(4)在步骤(3)所得的聚丙烯酰胺微球混合物B中加入DNA连接酶得到混合体系N，将寡核苷酸序列D3、辅助序列RC3与混合体系N混合，得到与D1、D2和D3连接的聚丙烯酰胺微球，收集并重悬聚丙烯酰胺微球于水相中获得具有分子标签序列的聚丙烯酰胺微球。进一步地，所述微球的直径与市场上微流控芯片常用的流道尺寸30～300微米，容易占满流道，使得液滴能够在流道中整齐单列排布。本专利技术聚丙烯酰胺微球具有特定的核苷酸序列，具有如下有益效果：1、体积较大，根据市场上常用微流控芯片流道尺寸定制，且稳定性高；2、由于聚丙烯酰胺微球质地稍软、微弹，在实际使用中可单独占满一条流道并排列整齐，比硬质材料在流道内更不容易堵塞；3、明显降低液滴包裹单个微球的难度，使得该微球比传统硬质小微球更适用于基于液滴微流控的单细胞测序，单包裹率大于80％，提高了单细胞测序结果的稳定性和精确性；4、聚丙烯酰胺微球表面修饰链接有三段或以上不同的寡核苷酸序列，使得微球种类众多。附图说明图1为聚丙烯酰胺微球测序示意图；包括依次顺序为：单细胞测序的目标细胞1、具有寡核苷酸序列的聚丙烯酰胺微球2、包含细胞裂解液的混合溶液3、带有表面活性剂的油4、成功单包裹目标细胞与具有寡核苷酸序列的聚丙烯酰胺微球的液滴5、液滴收集出口6。图2为聚丙烯酰胺微球的实物显微镜照片。图3为聚丙烯酰胺微球的实物荧光显微镜照片。图4为聚丙烯酰胺微球的尺寸分布图。图5为聚丙烯酰胺微球被包裹后的液滴图片。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。实施例聚丙烯酰胺微球的制备材料：试剂：T4连接酶、10×LigationBuffer均购买于NEB公司；TaqDNA聚合酶购买于Takara公司，40％丙烯酰胺溶液、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺购买于Sigma公司；1MTris-HCI(pH值8.0)、5MNaCl、丙烯酰胺/双丙烯酰胺19:1(40％(w/v)溶液)、DNase/RNase-FreeWater(无核酸酶水)购买于赛默飞；DropletGenerationOilforProbes购买于BioRad；TE(TE缓冲液)购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；HFE7100购买于3M。1、寡核苷酸的制备：D1的顺序为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT【X】A；D2的顺序为：CTG【Y】A；D3的顺序为：CTG【Z】TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；RC2的顺序为：ACTG【Y】ACTG的互补序列；RC3的顺序为：【Z】TTTTTTTTTTTTTTTTTTT的互补序列；以上X、Y、Z序列代表4-14bp长的任意DNA序列。为了实验方便，在本实施例中，我们各选取96种序列进行说明，9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有特定寡核苷酸序列的聚丙烯酰胺微球，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺微球表面依次修饰链接有三段寡核苷酸序列，D1、D2和D3；/n其中D1的顺序为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT【X】A；/nD2的顺序为CTG【Y】A；/nD3的顺序为CTG【Z】【polyT】；/n其中X、Y、Z分别代表4-14bp长的DNA序列，polyT代表10-35个T；/n三段寡核苷酸序列通过化学键和DNA连接酶或聚合酶连接起来。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有特定寡核苷酸序列的聚丙烯酰胺微球，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺微球表面依次修饰链接有三段寡核苷酸序列，D1、D2和D3；
其中D1的顺序为：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT【X】A；
D2的顺序为CTG【Y】A；
D3的顺序为CTG【Z】【polyT】；
其中X、Y、Z分别代表4-14bp长的DNA序列，polyT代表10-35个T；
三段寡核苷酸序列通过化学键和DNA连接酶或聚合酶连接起来。


2.根据权利要求1所述的聚丙烯酰胺微球，其特征在于，所述聚丙烯酰胺微球还含有辅助序列RC2、RC3；
RC2为ACTG【Y】ACTG的互补序列，RC3为【Z】【polyT】的互补序列；
RC2和RC3利用化学键和DNA连接酶或聚合酶连接到微球结构上。


3.根据权利要求1所述的聚丙烯酰胺微球，其特征在于，所述聚丙烯酰胺微球的结构为多微孔实心球结构，质地软韧、微弹，比硬质材料在流道内更不容易堵塞。


4.根据权利要求1所述的聚丙烯酰胺微球，其特征在于，所述聚丙烯酰胺微球可单独占满一条流道并排列整齐，且微球进入后续流道时间隔时间不变，通过流量控制微球进入主流道的速度，可实现对微球的单包裹。


5.根据权利要求1所述的聚丙烯酰胺微球，其特征在于，X代表6-12bp长的任意DNA序列。


6...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑文山，裴颢，汤王鋆，
申请(专利权)人：墨卓生物科技浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33