中华鳖胚胎期裙边成纤维细胞体外培养及损伤模型构建的方法技术

本发明专利技术公开了一种中华鳖胚胎期裙边成纤维细胞体外培养及损伤模型构建的方法，其特征在于，细胞来源于中华鳖特有的营养组织部位裙边性状形成的关键期，根据裙边组织分层结构特点，细胞具有不同类型胶原蛋白生成、分泌和沉积的功能特异性，主要包括以下步骤：原代培养，传代培养，细胞冻存，裙边成纤维细胞损伤模型构建。用浓度为160μg/mL脂多糖(LPS)处理裙边成纤维细胞4小时，可得到裙边成纤维细胞损伤模型。本发明专利技术具有成活率高、操作性好、特征性强、简单实用的优点。本发明专利技术中构建的中华鳖胚胎期裙边细胞体系可在分子细胞水平上研究中华鳖裙边特化性状的生成及其生理学作用。

【技术实现步骤摘要】
中华鳖胚胎期裙边成纤维细胞体外培养及损伤模型构建的方法
本专利技术涉及中华鳖特有的裙边组织细胞的体外培养，尤其涉及一种中华鳖胚胎期裙边成纤维细胞体外培养及损伤模型构建的方法。
技术介绍
中华鳖，学名Pelodiscussinensis，又名甲鱼、团鱼、水鱼等，是常见的特种经济动物，隶属于动物界、脊索动物门、爬行纲、龟鳖目、鳖科、鳖属。中国、日本、越南北部、俄罗斯东部、韩国均有野生中华鳖的存在，我国以长江流域和华南地区为多见。中华鳖因其风味独特，且具有较高的食用价值和药用价值，深受国内外消费者的喜爱。虽然龟鳖动物都具有背甲，但中华鳖与龟类的背甲外观明显不同。除了花纹有别外，龟的背甲由角质盾片和骨板构成，即龟的背甲是革质硬壳；而鳖是无角质盾片，以革质的皮肤覆盖在骨板表面，即鳖的背甲外表是革质软壳。中华鳖背甲边缘所覆盖的柔软的革质皮肤正是“裙边”组织。裙边即成为鳖科动物最具特征性的组织，为鳖科动物所特有。长期以来，裙边宽厚而饱满是评价中华鳖营养品质的关键，如野生中华鳖的裙边丰满，肉质鲜美，胶质浓郁；不同性别的中华鳖裙边性状也有差异，雄本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中华鳖胚胎期裙边成纤维细胞体外培养及损伤模型构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n原代培养：/n①将新鲜、正常大小的中华鳖受精卵放在26～32℃、相对湿度为70％～90％的孵化箱内孵化，以动物极朝上、全裸状态孵化至胚胎发育早中期，将受精卵表面用酒精浸泡灭菌后，于无菌环境下破壳取胚胎；/n②胚胎置于4℃预冷的含有双抗的磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中，弃去头部、四肢及内脏，剪取鳖尾部后缘的半透明状月牙型裙边组织，用磷酸盐缓冲溶液漂洗，酒精浸泡灭菌；/n③根据胚胎发育时期的不同，鳖裙边组织的大小有差异。发育早期的裙边组织需要小心分离，有针对性地选择最外部组织；/n④将裙边组织放入DMEM...

【技术特征摘要】
1.一种中华鳖胚胎期裙边成纤维细胞体外培养及损伤模型构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：
原代培养：
①将新鲜、正常大小的中华鳖受精卵放在26～32℃、相对湿度为70％～90％的孵化箱内孵化，以动物极朝上、全裸状态孵化至胚胎发育早中期，将受精卵表面用酒精浸泡灭菌后，于无菌环境下破壳取胚胎；
②胚胎置于4℃预冷的含有双抗的磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中，弃去头部、四肢及内脏，剪取鳖尾部后缘的半透明状月牙型裙边组织，用磷酸盐缓冲溶液漂洗，酒精浸泡灭菌；
③根据胚胎发育时期的不同，鳖裙边组织的大小有差异。发育早期的裙边组织需要小心分离，有针对性地选择最外部组织；
④将裙边组织放入DMEM培养基中清洗，再移到含双抗的DMEM培养基中清洗，然后移入完全培养基，将组织剪碎至1～2mm3大小，转移至离心管后再用完全培养基清洗，离心去培养基；
⑤加入胶原酶或胶原酶和其他蛋白酶混合物，室温消化，期间用移液枪反复吹打使组织块散开，加入完全培养基终止消化，离心去上清，用完全培养基重悬后转移到培养瓶中，置于31℃、体积百分比5％CO2、90％湿度的培养箱中进行原代培养，每2～3天更换1次完全培养基；
传代培养：
⑥待细胞增殖铺满细胞培养瓶底部至80％以上时，用胶原酶或胶原酶和其他蛋白酶混合物消化，加入完全培养基终止消化，吹打混匀后离心收集细胞，加入完全培养基重悬，按体积比1:2～1:3进行传代培养，每2～4天传代一次；
细胞冻存：
⑦取生长对数期的细胞，经胶原酶或胶原酶和其他蛋白酶混合物消化、完全培养基终止、离心去上清后，向细胞沉淀中加入细胞冻存液，使细胞的密度大于1×106个/mL，将细胞悬液转移至冻存管中进行保存。
细胞损伤：
⑧将步骤⑥中得到的细胞接种在12孔细胞培养板中，置于培养箱中培养，待汇合度达90％时吸弃原有完全培养基，添加含5％FBS的DMEM培养基，并每孔加入160μg/mLLPS干预4小时，可得到细胞损伤模型。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤①中所述的胚胎早中期为16期至2...

【专利技术属性】
技术研发人员：周贝宁，李彩燕，宋伟，钱国英，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33