本发明专利技术属于单克隆细胞系的技术领域，具体涉及一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系及其应用。所述昆虫细胞系为Hi‑N2，其保藏编号为CCTCC NO:C2020265，所述细胞系可应用于重组蛋白生产平台，以及应用于研究和制造生物产品。所得细胞系生长速快、细胞密度高、传代稳定地生长且不会结团；同时可高效表达外源基因，并且无诺达病毒，经过支原体检测、无菌检测和诺达病毒检测后，该细胞系支原体和无菌检测均合格，且无诺达病毒。该细胞系能够用无血清昆虫培养基在贴壁培养与悬浮培养之间相互转换培养，能够耐受高密度的细胞培养，方便用于表达外源基因，获得高表达水平的目标蛋白，减少其外源病毒风险。
【技术实现步骤摘要】
一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系及其应用
本专利技术属于单克隆细胞系的
，具体涉及一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系及其应用。
技术介绍
杆状病毒-昆虫细胞系统(BICS)被广泛用作重组蛋白生产平台，用于研究和制造生物产品。最常用于研究和生产重组蛋白表达的昆虫细胞西来自于两种蛾类:秋粘虫(spdopterafrugiperda，Sf)和卷心菜垂羽(Trichoplusiani，Tn)。最常用的Tn细胞系是BTI-Tn-5B1-4，也称为Hi-5，据报道，Hi-5细胞比Sf细胞系如Sf9表达重组蛋白的水平更高，但是Hi-5细胞以及Tn细胞系均存在一个严重的问题，即这些细胞都感染了诺达病毒。诺达病毒是在2007年被日本国家流行症研讨所的一个小组初次发现的，当他们用编码戊型肝炎病毒衣壳蛋白的重组杆状病毒感染Hi-5细胞，他们发现这些细胞除了产出预期的杆状病毒和戊型肝炎病毒样颗粒，还有甲型诺达病毒。诺达病毒是一个非包膜等长病毒家族，诺达病毒颗粒直径29～35nm，由两段单链RNA组成，共包装成一个病毒粒子。RNA1大小约为3.1kb，名为编码蛋白A的蛋白质，该蛋白质由多个功能结构域组成：线粒体靶向结构域、跨膜结构域、RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)结构域、自作用结构域和RNA封闭域，此外，RNA1编码一个亚基因组RNA3，该RNA3翻译蛋白B2，一种RNA沉默抑制剂；RNA2编码病毒衣壳蛋白前体蛋白a，在病毒组装过程中，蛋白a在保守的Asn/Ala位点被自动切割成两种成熟蛋白，即38kDab蛋白和5kDag蛋白。诺达病毒有两个属α-诺达病毒和β-诺达病毒，β-诺达病毒是导致全世界养殖鱼类死亡的病原体之一，而α-诺达病毒一般不被以为是哺乳动物的病原体。但有几项研究表明诺达穆拉病毒，α-诺达病毒的一种，经由白纹伊蚊媒介传播，乳鼠可以实验性感染诺达穆拉病毒。这些实验性感染可引起神经坏死，和椎旁及肢体骨骼肌变性，导致后肢瘫痪的无症状性麻木和感染后的1-2周内逝世。可是除了这几项研究报导外，只在昆虫中发现α-诺达病毒。并且，除了乳鼠外，脊椎动物(包含成年小鼠、兔、豚鼠和雏鸡)在被诺达穆拉病毒感染后没有呈现任何疾病迹象。所以现在尚不清楚α-诺达病毒对哺乳动物的潜在生物损伤。但这还是使人们对被诺达病毒感染的Tn细胞系存在的潜在风险起了担忧，特别是考虑到Tn细胞不仅被用作生产用于研究目的的重组蛋白的底物，而且在生物技术行业中也被用于生产用于人类药物的生物制品。由于诺达病毒对人类患者的风险尚未明确评估，因此诺达病毒需要被有效的清除或灭活以及严格的质量控制，以确保在诺达病毒污染的细胞系中生产的生物制品是安全的。然而，更直接和可靠的方法是使用无诺达病毒的细胞系。最好该细胞系还具有一些其他功能，以增强其作为BICS的作用，其一是在无血清培养基中高效表达重组蛋白的能力；另一个是作为悬浮细胞在无血清培养基中培养快速、稳定地生长且不会结团，因为这是Hi-5细胞最为突出的问题。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系及其应用，该细胞系具有生长速度快、密度高、传代稳定地生长且不易结团等优点，可高效表达外源基因等特性。本专利技术的
技术实现思路
如下：本专利技术提供了一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系，所述昆虫细胞系命名为Hi-N2，也称为无诺达病毒的昆虫细胞Hi-N2，其保藏编号为CCTCCNO:C2020265；所述单克隆昆虫细胞系Hi-N2已于2021年2月3日保存到中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，武汉大学。所述单克隆昆虫细胞系Hi-N2的制备方法，包括如下步骤：1)筛选：选取Hi-5细胞，解冻复苏，将细胞用Grace’s培养基+10％FBS通过有限稀释发进行细胞克隆化，挑选细胞一致性较好，形态均一，外观饱满的细胞株扩大培养，经过一系列实验鉴定，选出8个单克隆候选细胞株保存；2)驯化：用无血清昆虫培养基逐步至完全替代Grace’s培养基，使得单克隆细胞株能用无血清悬浮培养基在三角锥瓶中悬浮培养，挑选快速、稳定地生长且不会结团的克隆细胞进行保存，该克隆细胞即为无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系Hi-N2。本专利技术还提供了一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系应用于重组蛋白生产平台，以及应用于研究和制造生物产品。本专利技术的有益效果：本专利技术的一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞Hi-N2，具有生长速度快、快速密度高、传代稳定地生长且不易会结团等优点，可高效表达外源基因等特性；并且其经过支原体检测、无菌检测和诺达病毒检测后，该细胞系支原体和无菌检测均合格，且无诺达病毒；所得细胞系生长速度更快、获得的细胞量更多，有利于发酵生产，能够用无血清昆虫培养基在贴壁培养与悬浮培养之间相互转换培养，不影响细胞生物学特性；能够耐受高密度的细胞培养，可以用来感染重组杆状病毒，方便用于表达外源基因，获得高表达水平的目标蛋白，减少其外源病毒风险。附图说明图1为RT-PCR分析法检测Hi-N2、Hi-5(1D6)、Hi-5(2A8)、Hi-5(2B5)细胞的诺达病毒结果图；图2为RT-PCR分析法检测Hi-N2、Hi-5(1D6)、Hi-5(2A8)、Hi-5(2B5)细胞的诺达病毒结果图；图3为Hi-5细胞和Hi-N2、Hi-5(1D6)、Hi-5(2A8)、Hi-5(2B5)细胞的生长曲线图；图4为Hi-N2细胞在无血清培养基中的生长曲线图；图5为Hi-5感染绿色荧光杆状病毒BV-EGFP效率图；图6为Hi-N2感染绿色荧光杆状病毒BV-EGFP效率观察图；图7为Hi-5(1D6)感染绿色荧光杆状病毒BV-EGFP效率图；图8为Hi-5(2A8)感染绿色荧光杆状病毒BV-EGFP效率图；图9为Hi-5(2B5)感染绿色荧光杆状病毒BV-EGFP效率图；图10为Hi-5细胞和Hi-N2、Hi-5(1D6)、Hi-5(2A8)、Hi-5(2B5)细胞生产杆状病毒的能力比较；图11为Hi-5和4个单克隆细胞株表达重组杆状BV-2020-161病毒蛋白的表达能力图。具体实施方式以下通过具体的实施案例以及附图说明对本专利技术作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。若无特殊说明，本专利技术的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。实施例一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系的建立：1)Hi-5细胞选取：选取Hi-5细胞，按照细胞信息单用Grace’s培养基(Gibco，lifetechnolofies，批号：2085352)+10％FBS(Gibco，lifetechnolofies，批号：2045512CP)在28℃贴壁培养，之后进行传代培养，冻存于液氮中；2)Hi-5细胞解冻复苏：从冻存的Hi-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系。/n
【技术特征摘要】
1.一种无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系。
2.由权利要求1所述的无诺达病毒的单克隆昆虫细胞系，其特征在于，所述昆虫细胞系命名为Hi-N2，其保藏编号为CCTCCNO:C2020...
【专利技术属性】
技术研发人员：王弋，梁燕华，刘昕，陈怡林，刘秋云，段巧梅，韦炎冶，覃柳斌，
申请(专利权)人：东莞博盛生物科技有限公司，广州源博医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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