肽的合成方法技术

本发明专利技术涉及通过连续延伸肽链的第二末端来合成肽或蛋白质的方法，肽链的羧酸官能团(C端)或胺官能团Nα与可溶于非极性溶剂的锚定分子连接，其特征在于，所述锚定分子包括具有至少10个单体单元、并且优选为15个至50个单元的聚烯烃链。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肽的合成方法
本专利技术涉及有机化学领域，并且更具体而言涉及由氨基酸合成肽或蛋白质。本专利技术涉及用于在液相中体外合成肽的方法，该方法不使用固体基底或不溶性树脂。该方法基于使用新的锚定分子家族，即聚烯烃的衍生物或者聚烯烃或聚烯烃类(polyalcènes)的低聚物，新的锚定分子家族与氨基酸或氨基酸衍生物结合，在非极性溶剂中表现出良好的溶解性，但在水中表现出较差的溶解性。该方法使得能够获得比使用固体基底或液体基底的已知方法更纯并且/或者更容易纯化的肽。这易于自动化。
技术介绍
肽的药理学具有巨大的医学和经济利益，但是从科学观点出发，它仍然在蛋白质和遗传生物化学的范畴内。尽管胰岛素(由51个氨基酸组成的天然蛋白质)取得了巨大的成功，但在20世纪末，作为活性药物成分所开发的肽的数量仍然很少。然而，大约三十种由肽组成的新的活性成分在2000年至2016年之间取得了销售授权，并且相当数量的肽正在进行临床和临床前试验(参见A.Henninot等人的出版物，“TheCurrentStateofPeptideDrugDiscovery:BacktotheFuture？”，发表于J.Med.Chem.,2018,61,4,1382-1414)。这些候选药品中的大多数是因其特定功能而为人所知的天然肽，其他一些衍生自天然序列，并且还有一些完全是合成的。至于施用于数百万患者的胰岛素，通过基因修饰的生物体合成胰岛素是获得足够纯的工业量的优选途径。对于许多其他治疗性肽，从头合成(即，从单个氨基酸合成)是用于获得必要量的主要方法。在这种情况下，肽纯度是所选择的合成方法的主要技术和经济挑战。同时，环境因素成为日益重要的社会焦点。为此，化学家正在寻找符合这一标准的方法(参见A.Isidro-Llobet等人的出版物，“SustainabilityChallengesinPeptidesynthesisandPurification:FromR&DtoProduction,”，发表于J.Org.CHEM.,2019,84,4615-4628)。肽的纯化(通常通过高效液相色谱HPLC进行)可能占成品成本价格的大部分，但也可能产生废物。有两种主要的肽合成方法，其特征在于发生化学反应的相的物理状态不同：液相(该合成也称为“溶液合成”)和固相(该合成也称为“固相合成”)。所有氨基酸都具有至少两个反应性化学官能团：胺官能团(Nα中心)和羧酸官能团(C端)。某些氨基酸还具有能够与Nα中心或C端反应的侧链。肽合成策略的关键在于保护基的选择，通过保护基在方法的某些步骤中保护反应中心。因此，每加入一个氨基酸都需要如下的循环步骤：保护-活化/偶联-去保护。在合成结束时，切除保护基以产生靶标肽。因此，根据发生肽合成的相的物理状态，常见的基本循环：保护-活化/偶联-去保护是不变的，只是使用的保护基不同。更具体而言，这种循环包括几个步骤：-用在氨基酸缩合反应后可切除的保护基来保护氨基酸的胺官能团(Nα)；-如果需要，用在肽合成结束时可切除的保护基来保护侧链；-活化受保护的氨基酸Nα的羧酸官能团，然后其与胺官能团Nα游离且羧酸官能团受保护的氨基酸衍生物或肽缩合；-在序列中所有氨基酸的迭代(活化/偶联-去保护)结束时，通过保护基的完全去保护获得靶标肽。这里以三肽的合成为例来解释保护-活化/偶联-去保护循环。根据反应式1所示的称为“Boc”的解决策略，提供第一、第二和第三氨基酸(这里称为AA1、AA2和AA3)。由叔丁氧羰基(通常称为“Boc”)暂时保护氨基酸AA2的胺官能团(Nα)。然后我们活化所述受保护的氨基酸的羧酸官能团(C端)，其与氨基酸AA1的甲酯的游离(即，未保护的)胺官能团(Nα)缩合，从而产生二肽。接下来，将所得二肽的氨基酸AA2的胺官能团(Nα)去保护(即，用诸如三氟乙酸之类的酸切除保护基Boc)。氨基酸AA3的胺官能团(Nα)受保护。然后，我们使氨基酸AA3的羧酸官能团(C端)活化，其结合(去保护的二肽的)氨基酸AA2的胺官能团(Nα)，以产生受保护的三肽。在将AA3携带的Boc基团去保护后，获得三肽。该方法包括最少五个反应步骤，对于添加到肽中的每个额外氨基酸包括两个步骤(活化/偶联-去保护)。[化学1]反应式1：可以将氨基酸AA1锚定于固体基底或锚定于液相中的有机增溶分子从而进行该方法。根据反应式2所示的称为“Fmoc”的策略，可将芴基甲氧羰基用作胺官能团的保护基。该策略特别适合于在固体基底上的合成。提供了第一、第二和第三氨基酸(AA1、AA2和AA3)。这全部始于用芴基甲氧羰基(通常称为“Fmoc”)保护氨基酸AA1的胺官能团(Nα)，然后通过其羧酸官能团(C端)将其锚定到固体树脂(在反应式2中用黑色圆圈表示)，从而与官能化树脂的化学官能团(醇或胺)形成酯或酰胺类型的共价键连接的共价键。将锚定到树脂上的氨基酸的胺官能团(Nα)去保护。然后用Fmoc保护基保护氨基酸AA2的胺官能团(Nα)。将所得衍生物的羧酸(C端)活化从而使其与锚定到树脂上的氨基酸AA1的胺官能团(Nα)结合，从而产生锚定到树脂上的N-保护二肽。切除二肽的Fmoc基团(在AA2上)。由Fmoc基团保护氨基酸AA3的胺官能团(Nα)，然后活化其羧酸(C端)，然后使所得物偶联到具有游离胺官能团的锚定二肽上，从而产生N-保护三肽，N-保护三肽通过其氨基酸AA1的酸官能团(C端)保持与固体基底连接。该方法包括最少七个反应步骤，对于添加到肽中的每个额外氨基酸包括两个步骤(活化/偶联-去保护)。[化学2]反应式2：这两种合成途径是本领域技术人员公知的(参见D.Voet和J.G.Voet的标题为“Biochimie”[Biochemistry]的手册(第2版，Brussels2005)的第7-5节)。可以在液相中或在固体基底上(在这种情况下，氨基酸与固体基底连接，即Merrifield合成)实施该合成途径。实际上，所提供的氨基酸处于Fmoc-或Boc-保护状态，并将处于这种保护状态的氨基酸直接用于活化/偶联反应。在液相肽合成(LPPS)过程中，全部反应都在均相溶液中进行。Bodansky和duVigneaud(J.Am.Chem.Soc.,1959,51,5688-5691)已经描述了这种方法。起始氨基酸的羧酸官能团(C端)以甲酯的形式受到保护，并且随后的氨基酸在其胺官能团(Nα)受苄氧羰基保护并且其羧酸官能团(C端)被硝基苯基酯活化之后进行连续缩合。通过沉淀或用水洗涤(萃取)来纯化全部合成中间体。这种肽合成方法冗长且繁琐，并且生成肽的收率低。例如，如Schwyzer和Sieber(Helv.Chim.Acta1966,49,134-158)所述，ACTH合成的总收率为约7％。Beyermann等人(Ree.Trav.Chim.Holland1973,92,481-492)报道了对该方法的改进。其包括以苄基酯的形式保护氨基酸或肽的羧酸官能团(C端)，并在过量的N-保护氨基酸(N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过连续延伸肽链的第二末端(Nα)来合成肽或蛋白质的方法，所述肽链的第一末端通过所述肽链的羧酸官能团(C端)或所述肽链的胺官能团(Nα)与可溶于非极性溶剂的锚定分子连接，其特征在于，所述锚定分子包括具有至少10个单体单元、并且优选15个至50个单元的聚烯烃链。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181224 FR 18740911.一种通过连续延伸肽链的第二末端(Nα)来合成肽或蛋白质的方法，所述肽链的第一末端通过所述肽链的羧酸官能团(C端)或所述肽链的胺官能团(Nα)与可溶于非极性溶剂的锚定分子连接，其特征在于，所述锚定分子包括具有至少10个单体单元、并且优选15个至50个单元的聚烯烃链。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述锚定分子仅包括一个聚烯烃链。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚烯烃链为聚异丁烯链。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述锚定分子为聚烯烃。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚烯烃链的末端中的一个被官能化。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚烯烃链包括不超过5％、并且优选为不超过3％的多个不饱和碳-碳键。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚烯烃链的质量平均分子量在600至20,000之间、并且优选在700至15,000之间。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述锚定分子包括由选自以下所组成的组中的基团封端的聚烯烃链(或为由选自以下所组成的组中的基团封端的聚烯烃链)：
○-X官能团，其中X选自由以下组成的组：-OH、-NH2、-SH；
○-Z-C6...

【专利技术属性】
技术研发人员：让雅克·优特·坦敦格，奥德蕾·塞尔，
申请(专利权)人：斯特兰化学公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR