一种用于马铃薯腐烂茎线虫的可视化检测的检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于马铃薯腐烂茎线虫的可视化快速检测的检测试剂盒及其应用。本发明专利技术提供了一种鉴定马铃薯腐烂茎线虫的引物，其由引物F和引物R组成；所述引物F为序列1所示的单链DNA分子；所述引物R为序列2所示的单链DNA分子。本发明专利技术提供一种用于马铃薯腐烂茎线虫的可视化快速检测的检测试剂盒及其应用，为野外检测与现场诊断提供技术支撑。本发明专利技术所述扩增技术操作简便，无需专门学习，与胶体金层析试纸条法结合后，检测结果可直接用肉眼观察，能够辅助处理当前植物检疫和植物保护方面亟需解决的难题。

【技术实现步骤摘要】
一种用于马铃薯腐烂茎线虫的可视化检测的检测试剂盒及其应用
本专利技术属于植物寄生线虫的检测
，具体涉及一种用于马铃薯腐烂茎线虫的可视化检测的检测试剂盒及其应用。
技术介绍
腐烂茎线虫(Ditylenchusdestructor,Throne,1945)是一类全球检疫性有害生物，寄主范围达100多种，马铃薯是其主要寄主，引起马铃薯干腐病。腐烂茎线虫于1937年由日本传入我国北方地区，目前在河北、内蒙、陕西、吉林、辽宁、山东、河南、安徽等省市均有发生，可严重危害马铃薯和甘薯的整个生育期及贮藏期。2020年11月新修订的《全国农业植物检疫性有害生物名单》中列有3种检疫性植物线虫，腐烂茎线虫是其中之一。2019年我国马铃薯播种面积达8600多万亩，种植面积和产量均居世界第一，而马铃薯腐烂茎线虫病是制约我国马铃薯产业发展的主要病害之一，大田期一般导致减产20％～30％，严重时减产达50％甚至绝收，贮藏期引起烂窑，严重的烂窑高达50％。目前马铃薯腐烂茎线虫病害流行，地方人员无法及时对田间样品进行快速检测，导致无法给予农业生产病害及时的指导。因此，迫切需要寻找一种方便快捷的马铃薯腐烂茎线虫的现场检测诊断技术。传统的形态学鉴定该线虫需要丰富的经验和技术,是一项耗时且比较困难的工作。而以DNA为基础的分子诊断技术系目前较稳定可靠的鉴别方法,由于其不依赖于基因组的表达产物,也不受环境影响和线虫发育阶段的限制,直接测定线虫的遗传物质(DNA),因而成为最有潜力的线虫诊断工具。其中PCR基因扩增技术因其简单易行而广泛应用，但需依赖价格昂贵的加热与制冷的热循环仪,会受到环境与设备的限制，难以大范围推广使用。为了满足实验室外现场诊断与床边诊断的需求，研究者们又开发了不需要温度变换的等温核酸扩增技术。恒温扩增技术的扩增阶段对仪器的要求低；视觉直观检测，不需要检测仪；反应速度快，敏感性高；用多个引物，特异性好；价格便宜。重组酶聚合酶技术是由英国剑桥ASMScientificLtd的NiallArmes等人于2006年开发的一种可进行快速检测的新型等温核酸扩增方法。它的原理是利用重组酶促进寡核苷酸引物，在DNA双链互补序列中的插入和结合，以及类似于PCR的方式实现对DNA的特定区域进行指数扩增。该方法可在恒温条件下完成核酸扩增，比其他等温检测方法及PCR检测速度更快，其优势包括：1)反应温度低。不需要在较高温度下进行，在37℃-42℃就能完成扩增。(2)反应速度快。反应在5-30min内即可完成，扩增效率高。(3)灵敏度好且特异性高。(4)稳定性强。反应试剂以冻干形式提供，增加了稳定性，运输和储藏过程不需要冷藏，更加符合现场快速诊断的要求。(5)设备要求低。反应只需要恒温，对设备的要求低，设备成本比传统PCR或real-timePCR要低，也可以免除昂贵的仪器投入。(6)便携快速。不受场地限制，在野外缺少设备时可以利用人体腋窝保温进行检测，便于相关从业人员提供及时指导。(7)简便直观。扩增技术操作简便，无需专门学习，与胶体金层析试纸条法结合后，检测结果可直接用肉眼观察。该技术为野外检测与现场诊断提供了极大的便利，目前已应用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业生产等多个领域。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供一种鉴定马铃薯腐烂茎线虫的引物。本专利技术提供的引物，其由引物F和引物R组成；所述引物F为如下a或b:a为序列1所示的单链DNA分子；b为序列1删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述序列1具有相同功能的序列的衍生物；所述引物R为如下c或d:c为序列2所示的单链DNA分子；d为序列2删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述序列2具有相同功能的序列的衍生物。上述引物R的5'末端标记生物素。本专利技术另一个目的是提供一种鉴定马铃薯腐烂茎线虫的试剂。本专利技术提供的试剂，包括上述的引物和探针；所述探针由序列3所示的单链DNA分子、T四氢呋喃和序列4所示的单链DNA分子组成。上述试剂中，所述探针的5'末端标记荧光基团，且所述探针的3'末端修饰SpacerC3。含有上述引物或上述试剂的PCR试剂或试剂盒也是本专利技术保护的范围。上述试剂盒还包括凝胶电泳相关试剂或侧流层析试纸条。所述试剂盒用于辅助鉴定马铃薯腐烂茎线虫和/或检测待测样本中是否含有马铃薯腐烂茎线虫；所述试剂盒的侧流层析试纸条法相关的扩增反应体系包括：冻干反应颗粒、2.1μL浓度为10μM的所述上游引物、2.1μL浓度为10μM的所述下游引物、0.6μL浓度为10μM的上述探针、29.5μL不含引物的重泡胀缓冲液、2.5μL浓度为280mM乙酸镁(MagnesiumAcetate)以及12.2μLDEPC水。为了更加直观、准确地判定检测结果，所述的试剂盒较佳地还包括阴性对照和/或阳性对照。所述的阴性对照优选DEPC水。所述的阳性对照优选马铃薯腐烂茎线虫DNA。上述引物或上述试剂的PCR试剂或试剂盒在如下中的应用也是本专利技术保护的范围：1)鉴定或辅助鉴定马铃薯腐烂茎线虫；2)鉴定或辅助鉴定待测线虫是否为马铃薯腐烂茎线虫；3)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有马铃薯腐烂茎线虫。上述应用中，待测样本为植物或者土壤。本专利技术另一个目的是提供如下方法。本专利技术提供一种鉴定待测样本中是否含有马铃薯腐烂茎线虫的方法，包括如下步骤：用第一个目的中的引物对待测样本(基因组DNA)进行重组酶聚合酶扩增，电泳检测扩增产物；若所述扩增产物大小为155-165bp(具体为161bp)，则所述待测样本含有或候选含有马铃薯腐烂茎线虫；若所述扩增产物大小不为155-165bp，则所述待测线样本不含有或候选不含有马铃薯腐烂茎线虫；或，本专利技术提供了一种鉴定待测线虫是否为马铃薯腐烂茎线虫的方法，包括如下步骤：用第一个目的中的引物对待测线虫进行重组酶聚合酶扩增，电泳检测扩增产物；若所述扩增产物大小为155-165bp，则所述待测线虫为或候选为马铃薯腐烂茎线虫；若所述扩增产物大小不为155-165bp，则所述待测线虫不为或候选不为马铃薯腐烂茎线虫。上述方法中，所述重组酶聚合酶等温扩增的反应时间优选20min,温度优选37℃；反应体系优选为在冻干反应颗粒中加入1μL目的基因、2.4μL浓度为10μM的所述第二组上游引物、2.4μL浓度为10μM的所述第二组下游引物、29.5μL不含引物的重泡胀缓冲液、2.5μL浓度为280mM乙酸镁(MagnesiumAcetate)以及12.2μLDEPC水；进一步地，将上述方法所得的扩增产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳(120V),30分钟后记录结果。或本专利技术提供了一种鉴定马铃薯腐烂茎线虫的方法，包括如下步骤：用第二个目的中的引物和探针对待测样本进行重组酶聚合酶扩增，侧流层析试纸条检测扩增产物；若所述试纸条的质控线和检测线全部出现条带，则待测样本含有或候选含有马铃薯腐烂茎线虫；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定马铃薯腐烂茎线虫的引物，其由引物F和引物R组成；/n所述引物F为如下a或b:/na为序列1所示的单链DNA分子；/nb为序列1删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述序列1具有相同功能的序列的衍生物；/n所述引物R为如下c或d:/nc为序列2所示的单链DNA分子；/nd为序列2删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述序列2具有相同功能的序列的衍生物。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定马铃薯腐烂茎线虫的引物，其由引物F和引物R组成；
所述引物F为如下a或b:
a为序列1所示的单链DNA分子；
b为序列1删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述序列1具有相同功能的序列的衍生物；
所述引物R为如下c或d:
c为序列2所示的单链DNA分子；
d为序列2删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述序列2具有相同功能的序列的衍生物。


2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述引物R的5'末端标记生物素。


3.一种鉴定马铃薯腐烂茎线虫的试剂，包括权利要求2所述的引物和探针；
所述探针由序列3所示的单链DNA分子、T四氢呋喃和序列4所示的单链DNA分子组成。


4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述探针的5'末端标记荧光基团，且所述探针的3'末端修饰SpacerC3。


5.含有权利要求1或2所述引物或权利要求3或4所述试剂的PCR试剂或试剂盒。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括凝胶电泳相关试剂或侧流层析试纸条。


7.权利要求1或2所述引物或权利要求3或4所述试剂的PCR试剂或试剂盒在如下中的应用：
1)鉴定或辅助鉴定马铃薯腐烂茎线虫；
2)鉴定或辅助鉴定待测线虫是否为马铃薯腐烂茎线虫；
3)鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有马铃薯腐烂茎线虫。


8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：待测样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩，陈潇威，简恒，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11