骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途制造技术

本发明专利技术提供了骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途。具体涉及分离骨髓间充质干细胞上清液获取外泌体并应用于芥子气引起的急性肺损伤。利用本发明专利技术所述方法获得外泌体在芥子气暴露下能显著提高实验动物生存率并提高肺细胞活性，通过改善芥子气引起的肺紧密连接蛋白的变化，抵抗芥子气肺损伤作用。因此，本发明专利技术为芥子气引起的急性肺损伤提供了一种新的治疗途径。

【技术实现步骤摘要】
骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途以及包含该外泌体的药物组合物。
技术介绍
芥子气(sulfurmustard,SM)是一种糜烂性毒剂，中毒后可致皮肤起疱，眼睛、肺、肝脏、脾脏等多器官受累，但目前中毒机制不明，尚无特效治疗药物，其中暴露引发的肺损伤是致死的主要原因，表现为短期以炎症反应为主的急性肺损伤以及长期的肺纤维化(WolfeGA,PetteysSM,PhelpsJF,WasmundJB,PlackettTP.SulfurMustardExposure:ReviewofAcute,Subacute,andLong-TermEffectsandTheirManagement.Journalofspecialoperationsmedicine:apeerreviewedjournalforSOFmedicalprofessionals2019；19:81-6.)。骨髓间充质干细胞(BMSC)是具有多分化潜能的干细胞，来源丰富，收集操作简便，目前许多研究已经证明BMSC能通过降低炎症因子表达，调节免疫反应改善急性肺损伤。之前，课题组已经就BMSC对芥子气引起的急性肺损伤的治疗作用进行了探究，发现BMSC可以通过改善肺部炎症反应及屏障功能促进芥子气急性肺损伤修复。(FengY,XuQ,YangY,ShiW,MengW,ZhangH,etal.Thetherapeuticeffectsofbonemarrow-derivedmesenchymalstromalcellsintheacutelunginjuryinducedbysulfurmustard.Stemcellresearch&therapy2019；10:90)。但一方面，BMSC仍存在形成肿瘤的可能及长期的安全问题，应用还存在一定风险(LeeHY,HongIS.Double-edgedswordofmesenchymalstemcells:Cancer-promotingversustherapeuticpotential.Cancerscience2017；108:1939-46)；另一方面，细胞培养条件要求苛刻且难形成制剂，限制了其临床应用。外泌体(Exosomes)是多种细胞分泌的直径介于40～150nm的脂质双分子层结构，包含多种生物活性物质(蛋白质、DNA和RNA等)，能通过胞吞作用被摄入细胞进行信息传递，调节信号转导，发挥抗炎、抗氧化等各种生物功能。其免疫原性低，可以很好地被细胞吸收，是一种极好的信息载体(vanNielG,D'AngeloG,RaposoG.Sheddinglightonthecellbiologyofextracellularvesicles.NatRevMolCellBiol2018；19:213-28)。目前，尚未见外泌体与芥子气引起的急性肺损伤之间关联的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术是为解决上述技术问题进行的，目的在于提供骨髓间充质干细胞来源的外泌体的新用途、该外泌体的制备方法以及包含该外泌体的药物组合物。本专利技术经研究发现BMSC衍生的外泌体能治疗芥子气引起的急性肺损伤。通过超速离心法获得BMSC来源的外泌体，建立芥子气下实验动物模型及小鼠肺上皮细胞(MLE-12)模型后加入外泌体进行治疗，对芥子气暴露下实验动物生存率及体外细胞活性进行了检测并测定了细胞紧密连接蛋白分布与表达。结果显示，SM暴露下小鼠生存率明显下降，肺病理表现出血、水肿、炎症，肺上皮屏障功能明显受损，紧密连接不连续，紧密连接蛋白分子表达量下降，而BMSC来源的外泌体明显缓解了芥子气引起的肺部损伤，改善了紧密连接蛋白分子表达与定位，修复了肺屏障功能。本专利技术的第一方面，提供了骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途。优选的，所述药物为增强肺上皮细胞活性的药物。根据细胞毒性实验，相对于阴性对照组(SM)、阳性对照组(SM+NAC)，实验组(SM+BMSC-Ex)中肺上皮细胞活性明显增强(图4)。优选的，所述药物为药物为提高肺上皮细胞紧密连接相关蛋白表达水平或连接连续度的药物。免疫荧光实验以及RT-PCR检测结果显示，BMSC来源的外泌体明显改善了紧密连接蛋白分子表达与定位，修复了肺屏障功能(图5～图7)。动物模型实验显示，注射外泌体后的芥子气小鼠生存率明显提升，7天生存率由45％提升至75％，也远高于阳性对照组(SM+NAC)7天生存率为50％的结果。本专利技术的第二方面，提供了该外泌体的制备方法，如下：A、骨髓间充质干细胞培养将间充质干细胞培养基加入至骨髓间充质干细胞中，48～72h后收取培养上清液，所述间充质干细胞培养基的配方为：DMEM/F12培养基，10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素双抗。B、外泌体分离收集骨髓间充质干细胞培养上清液，2000g、4℃条件下离心10min后收取上清液，上清液经10000g、4℃条件离心30min后，再次收集上清液；再次收集的上清液经100000g、4℃，离心70min后弃上清，收集沉淀后PBS重悬，重复该操作后，收集沉淀溶于PBS中，得到的外泌体溶液。通过电镜观察，制备得到的外泌体呈囊泡状，直径为100nm左右。Westernblot及CM-Dil检测显示，外泌体的标志性蛋白CD63、CD81、CD9以及TSG101均被检测到，且CM-Dil标记的外泌体也完全被肺上皮细胞MLE-12吸收。本专利技术的第三方面，提供了一种骨髓间充质干细胞来源的外泌体组合物，包括骨髓间充质干细胞来源的外泌体以及稀释液，该稀释液优选为PBS，方便组合物作为注射剂使用。本专利技术的第四方面，提供了该外泌体组合物在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途。本专利技术的第五方面，提供了治疗芥子气引起的急性肺损伤的药物组合物，以骨髓间充质干细胞来源的外泌体为唯一活性组分。相比现有技术，本专利技术的技术效果如下：本专利技术提供了骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途。通过实验证实，相对于芥子气暴露下小鼠，BMSC来源的外泌体能够明显提高肺上皮细胞活性，同时明显上调肺上皮细胞紧密连接相关蛋白的分子表达与连接连续性，进而修复了肺屏障功能，缓解了芥子气引起的肺部损伤。因此，本专利技术为芥子气引起的急性肺损伤提供了一种新的治疗途径。附图说明图1为BMSC来源的外泌体鉴定，其中A为透射电子显微镜下外泌体，B为外泌体纳米颗粒跟踪分析，C为外泌体标志分子Westernblot检测，D为CM-Dil标记外泌体被MLE-12细胞摄取。图2为BMSC来源外泌体对于SM暴露下小鼠生存率的影响：CTRL：未进行任何处理的空白细胞对照组；SM：SM染毒小鼠组；SM+NAC：加入阳性对照药物NAC的S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途。/n

【技术特征摘要】
1.骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途。


2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途，其特征在于：
其中，所述药物为增强肺上皮细胞活性的药物。


3.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途，其特征在于：
其中，所述药物为提高肺上皮细胞紧密连接相关蛋白表达水平或连接连续度的药物。


4.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗芥子气引起的急性肺损伤药物中的用途，其特征在于，该外泌体的制备方法如下：
A、骨髓间充质干细胞培养
将间充质干细胞培养基加入至骨髓间充质干细胞中，48～72h后收取培养上清液，所述间充质干细胞培养基的配方为：DMEM/F12培养基，10％胎牛血清，1％青霉素/...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖凯，徐庆强，毛冠超，孙铭学，龚楚楚，王振，裴志鹏，孟文琪，岑金凤，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31