一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法技术

本发明专利技术涉及鱼类遗传育种领域，特别涉及一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法。该方法包括如下步骤：将精子和卵子混合，进行人工受精；受精4.5～5.5min后，将受精卵置于预冷的海水中进行冷休克处理；冷休克处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。本发明专利技术制备人工诱导三倍体石斑鱼的方法实现了石斑鱼冷休克诱导石斑鱼卵子，可培育出人工三倍体鱼苗，可实现获取多倍体鱼苗，提高了多倍体育苗效率。本技术操作方便、高效实用。

【技术实现步骤摘要】
一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法
本专利技术涉及鱼类遗传育种领域，特别涉及一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法。
技术介绍
通过远缘杂交产生多倍体是生物界普遍存在的现象。杂交产生多倍体不仅可能拥有杂种优势，而且不育的多倍体与它的双亲和普通的杂交子代比较，在体型、抗病、抗逆性、成活力、生存力等方面表现出更大的优势。从细胞遗传学角度来看，三倍体为非偶数染色体组，故阻碍了生殖细胞正常的减数分裂，结果常常导致性腺不能发育。在杂交三倍体中，即杂交受精卵通过三倍体诱导技术处理而培育出的三倍体，其不育性更高于普通三倍体。不育的三倍体经济鱼类因为没有性成熟阶段性腺发育的能量损耗，所以避免了性腺发育阶段的生长停滞和死亡率增加，且能量从配子生产转移到体细胞生长中，使得三倍体个体具有更快的生长速度，在生长能力方面具有潜在益处。目前已知的培育出的技术成熟的有三倍体鲤，它生长速度超过普通二倍体野鲤25％～30％，三倍体鲫鱼比二倍体生长速度快1～1.5倍。石斑鱼(Epinephelus)具有富含营养、肉质鲜美、低脂肪、高蛋白等特点，具有很高的营养价值和经济价值，是我国沿海地区和东南亚重要的养殖鱼类之一。杂交三倍体具有巨大的市场潜力和商业价值，能够大大加快产品上市时间且得到质量更高的个体。公开号为CN103004653A的中国专利技术专利公开了一种三倍体石斑鱼的制备方法，挑选遗传距离为0.140-0.145亲缘关系的不同种石斑鱼作为亲鱼，采用干法人工授精进行远缘杂交，卵子受精后转移到海水中进行冷体克处理，育苗经起捕、暂养后，进行三倍体鉴定。其中，卵子受精后转移到海水中进行冷休克处理，冷休克处理时的温度为4℃，冷休克处理时间为20～25min。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法。通过该方法实现获得三倍体石斑鱼群体。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法，包括如下步骤：将精子和卵子混合，进行人工受精；受精4.5～5.5min后，将受精卵置于预冷的海水中进行冷休克处理；冷休克处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。作为优选，精子与卵子的体积比为1：(50～150)。在本专利技术提供的具体实施例中，精子与卵子的体积比为1：100。作为优选，人工授精的方法为干法授精或湿法授精。作为优选，受精5min后，对受精卵进行冷休克处理。作为优选，冷休克处理的温度为1～9℃，时间为12.5～20min。优选地，冷休克处理的温度为1～9℃，时间为17.5～20min。更优选地，冷休克处理的温度为1～3℃或7～9℃，时间为20min。更优选地，冷休克处理的温度为4～6℃，时间为17.5min。在本专利技术中，精子为鞍带石斑鱼的精子。但本专利技术并非限定于此，其它种类的石斑鱼同样可实现本专利技术的技术效果。在本专利技术中，卵子为棕点石斑鱼的卵子。但本专利技术并非限定于此，其它种类的石斑鱼同样可实现本专利技术的技术效果。本专利技术提供了一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法。该方法包括如下步骤：将精子和卵子混合，进行人工受精；受精4.5～5.5min后，将受精卵置于预冷的海水中进行冷休克处理；冷休克处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。本专利技术具有的技术效果为：本专利技术制备人工诱导三倍体石斑鱼的方法实现了石斑鱼冷休克诱导石斑鱼卵子，可培育出人工三倍体鱼苗，可实现获取多倍体鱼苗，提高了多倍体育苗效率。本技术操作方便、高效实用。在石斑鱼生产和多倍体选育优良品种上具有重大应用价值和广阔的推广应用前景。本专利技术采用的父本鞍带石斑鱼具有产精量大，生长速度快的优势，母本棕点石斑鱼具有繁殖能力强，成活率高，耐高温的优点。附图说明图1为流式细胞仪二倍体和三倍体的倍性结果，A为二倍体，B为三倍体；图2为染色体核型图片。具体实施方式本专利技术公开了一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术中所用试剂或仪器均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1本专利技术获取人工诱导三倍体石斑鱼的方法，包括如下步骤：1、人工诱导石斑鱼三倍体(1)、石斑鱼亲本的选择以及精、卵子的采集a、父本的选择和精子的采集：选择无伤病、体型正常、体格健壮，体重为60～80kg/尾的鞍带石斑鱼雄性成鱼为父本，置于室外土塘或室内水泥池进行培育，投喂冰鲜杂鱼、鱿鱼和螃蟹进行培育；待海水平均温度稳定在28～32℃时，采用麻醉剂将其麻醉后捞出水面置于帆布担架内，用干布将泄殖孔及周围海水擦干，用手按压性腺，看到有精液流出立刻对其进行收集；得到鞍带石斑鱼鲜精后，置于0～4℃冷藏保存，避免接触海水防止精子激活。b、母本的选择和卵子的采集：选择腹部膨胀，体表无伤的棕点石斑鱼雌性成鱼为母本，置于室外土塘或室内水泥池培育，投喂冰鲜杂鱼和鱿鱼进行培育；在繁殖期，选择腹部饱满有弹性，两侧有明显的充盈感，生殖孔外凸的雌鱼个体，将其置于帆布担架内，用干布将泄殖孔及周围海水擦干，用手按压腹部，干净干燥的烧杯收集卵子，得到棕点石斑鱼卵子后，避免接触海水，尽快与精子进行人工受精。时间不超过30分钟。c、人工授精的方法：按照1mL精子授精100mL卵子的比例进行精卵人工混合，可使用干法授精和湿法授精。干法授精为：将精子：TS-19精子稀释液＝1：19的比例稀释精液，将稀释精液与卵子干法混合拌匀后，加入与卵子量等体积新鲜海水以激活精子，搅匀10s后，定为受精零时，混合后加入洁净自然海水搅拌30s，完成人工授精。湿法授精为：按精卵受精比例，将精子用移液枪/吸管/针筒等打进与卵等体积海水中，迅速搅散10s后倒入卵子迅速搅匀，设为受精零时，混合后加入洁净自然海水，温度为26-28℃，搅拌30s，完成人工授精。(2)授精时间、染色体加倍冷休克温度和持续时间的筛选及批量冷休克诱导石斑鱼卵子：使用制冷剂或者制冷设备(如冰柜、冻库)提前准备调好盐度的冷冻海水，于人工授精前调配温度备用；人工干法授精，设置的六个时间梯度分别为3min、4min、5min、6min、7min和8min，用海水冲洗受精卵除去多余的精子后立即转入装有预冷海水的冷休克处理箱中，在1-3℃，4-6℃，7-9℃三个温度梯度每个梯度分别低温休克处理10、12.5、15、17.5、20min；最后统计受精率、畸形率、孵化率，用Sysmex/CyFlowPloidyAnalyser倍性分析仪检测胚胎和鱼苗的倍性，结果表明在受精后4min、5min、6min、7min，4℃冷休克15m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n将精子和卵子混合，进行人工受精；/n受精4.5～5.5min后，将受精卵置于预冷的海水中进行冷休克处理；所述冷休克处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。/n

【技术特征摘要】
1.一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将精子和卵子混合，进行人工受精；
受精4.5～5.5min后，将受精卵置于预冷的海水中进行冷休克处理；所述冷休克处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精子与所述卵子的体积比为1：(50～150)。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工授精的方法为干法授精或湿法授精。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，受精5min后，对受精卵进行冷休克处理。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷休...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆剑，樊欣，张维炜，黄杰，纪馨馨，周可欣，姚富城，江甜，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南;46