本发明专利技术公开了一株具有纤溶活性的凝结芽孢杆菌，该菌株分类命名为凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)5885，于2020年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.20846。本发明专利技术的凝结芽孢杆菌5885可以产纤溶活性酶，对酶活性质的初步探究表明该酶活性可达619IU/mL；对温度相对稳定，在5‑35℃之间酶活性可以保持在80％以上；对pH有较宽适应性，在pH 4.0‑9.0之间可以保持80％以上的酶活，最适pH为8.5，酶活保持率为97.6％；且该酶既有直接纤溶活性，也有纤溶酶原激活活性。为新型纤溶酶的开发提供了重要的理论依据。
【技术实现步骤摘要】
一株具有纤溶活性的凝结芽孢杆菌
本专利技术属于微生物学
，具体涉及一株具有纤溶活性的凝结芽孢杆菌5885及其应用。
技术介绍
血栓性疾病是严重危害人类健康的常见病、多发病。目前，治疗血栓性疾病主要有种3方法：第一，外科手术，即用物理方法清除血栓或切除栓塞部位的血管而用塑料管代替，如冠脉搭桥术、冠脉支架移植术等。这种方法要求的条件复杂，费用高，且手术后易发生再栓塞。第二，保守疗法，即让患者长期服用抗凝剂，减低凝血倾向，这种方法常作为辅助治疗。第三，溶栓疗法，即注射溶栓药物使血管再通，由于其无创性，简便易行，价格较外科手术便宜，已成为目前广为流行的方法。目前的溶栓药物大都存在半衰期短，价格昂贵，毒副作用大等缺点。针对溶栓药物的上述问题，目前溶栓药物的研究主要集中在两个方面，一是对现有的溶栓药物进行改造；二是积极地从各种来源的生物材料中分离具有纤溶活性的新型溶栓酶。微生物是溶栓药物的重要来源。1987年，日本学者Sumi等[SumiH,HamadaH,TsushimaH,etal.Anovelfibrinolyticenzyme(nattokinase)inthevegetablecheeseNatto；atypicalandpopularsoybeanfoodintheJapanesediet.[J].Experientia,1987,43(10):1110.]在日本的传统发酵食品纳豆中发现了一种具有强烈纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，命名为纳豆激酶(Nattokinase,NK)。NK具有显著的溶栓效能，其纤溶活性约是纤溶酶的4倍。近年来，相继有国内外学者从传统豆类发酵食品中筛选出产纤溶活性酶的芽孢杆菌。本专利技术从发酵食品豆豉中分离到一株产纤溶活性酶的菌株，经鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。凝结芽孢杆菌是一种益生菌，可以产生乳酸，兼具芽孢杆菌和乳酸菌的优点，是工业发酵的重要微生物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种凝结芽孢杆菌5885及其在产纤溶活性酶中的应用。本专利技术还验证了该凝结芽孢杆菌菌株5885所发酵生产的纤溶性酶活性质。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：本专利技术从发酵食品豆豉中分离到一株产纤溶活性酶的凝结芽孢杆菌，该菌株分类命名为凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)5885，于2020年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCCNO.20846。申请人将其16srRNA序列提交到GenBank，登录号为MT754554。上述的凝结芽孢杆菌在产纤溶活性酶中的应用。一种生产纤溶活性酶的方法，该方法为发酵培养上述的凝结芽孢杆菌得到生产纤溶活性酶。一种纤溶活性酶，该纤溶活性酶由上述的凝结芽孢杆菌发酵培养得到。所述发酵培养的过程为：将所获菌种接种于液体发酵培养基，37℃、200r/min培养48h后离心取上清，获得具有纤溶活性的发酵液。制作含有1％的琼脂糖和0.3％的纤维蛋白原溶液以及0.1U/ml凝血酶的平板，打孔点样后于37℃温育18h，通过测定水解圈大小测得纤溶性酶活为619IU/mL。取培养48h的发酵液分别于5，15，25，35，45，55℃温育6h后用纤维蛋白平板法测定酶活发现该纤溶活性酶具有良好热稳定性，在5-35℃之间酶活性可以保持80％以上，在5-55℃之间具有60％以上的酶活。取培养48h的发酵液分别调pH至3.0，5.0，7.0，9.0，11.0，然后用纤维蛋白平板测定酶活，纤溶活性酶对pH有较宽适应性，在pH4.0-9.0之间可以保持80％以上的酶活，最适pH为8.5，酶活保持率为97.6％。制备纤维蛋白平板，将此平板在85℃恒温箱中加热40min，使残留在纤维蛋白中的纤溶酶原失活，打孔后加入培养48h的发酵上清液，置于37℃温育18h，测量溶解圈直径，计算得到直接纤溶活性为287IU/mL。另一纤维蛋白平板制作时，在纤维蛋白原中加入纤溶酶原，打孔后加入同样的上清液，测溶解圈直径，得激酶活性和直接纤溶酶活性之和为619IU/mL。二者差值，即该上清液的纤溶酶原激活活性为332IU/mL。本专利技术的有益效果：本专利技术提供一种具有纤溶活性的凝结芽孢杆菌5885及其酶活性质。对酶活性质的初步探究表明，该酶对温度相对稳定，在5-35℃之间酶活性可以保持80％以上；对pH有较宽适应性，在pH4.0-9.0之间可以保持80％以上的酶活，最适pH为8.5，酶活保持率为97.6％，经测定该酶活性可达619IU/mL；且该酶既有直接纤溶活性，也有纤溶酶原激活活性。为新型纤溶酶的开发提供了重要的理论依据。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本专利技术的基本特征，并且在不偏离本专利技术精神和范围的情况下，可以对本专利技术做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1：凝结芽孢杆菌的筛选将1g豆豉样品放入装有9mL无菌水的试管中，进行梯度稀释。分别取10-5、10-6和10-7三个梯度的稀释液涂布于固体LB平板(培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，NaCl5g/L，琼脂1.5g/L，调pH至7.2)。37℃培养16h后挑取单菌落接种于3mL液体LB发酵培养基(培养基配方为:胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，调pH至7.2)，37℃200r/min培养24h，离心取上清，测其纤溶活性。对具有高纤溶活性的菌株进行分离纯化，获得菌株凝结芽孢杆菌5885。并将其16srRNA序列提交到GenBank，登录号为MT754554。该菌株分类命名为凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)5885，于2020年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCCNO.20846。实施例2：具有纤溶活性发酵液的制备将所获菌种接种于3mL液体LB发酵培养基，37℃、200r/min培养16h得到种子液，将种子液按1：100的体积比例接种到200mL液体LB发酵培养基中，培养48h后离心取上清，获得具有纤溶活性的发酵液。实施例3：纤维蛋白原平板的制作将0.045g纤维蛋白原与0.15g琼脂糖分别溶于7.5mLPBS(NaCl8.76g/L，NaH2PO4·2H2O0.458g/L，Na2HPO4·12H2O2.618g/L，调pH至7.2)缓冲溶液中，前者置于37℃保温，后者经过加热溶解后，置65℃保温50min，取15U/mL的凝血酶100μL加入纤维蛋白原溶液中混匀后倒入琼脂糖溶液中，然后立即倒入直径为90mm培养皿中，室温放置，使其充分凝固后打孔(直径为3mm)。实施例4：酶的纤溶活性的测定采用纤维蛋白平板法测定酶活力。制作本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株凝结芽孢杆菌，该菌株分类命名为凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)，于2020年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.20846。/n
【技术特征摘要】
1.一株凝结芽孢杆菌，该菌株分类命名为凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)，于2020年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.20846。
2.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌在生产纤溶活性酶中的应用。
3.一种生产纤溶活性酶的方法，其特征在于，该方法为发酵培养权利要求1所述的凝结芽孢杆菌得到纤溶活性酶。
4.一种纤溶活性酶，其特征在于，该纤溶活性酶由权利要求1所述的凝结芽孢杆菌发酵培养得到。
5.根据权利要求4所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪洋，
申请(专利权)人：汪洋，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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