本发明专利技术公开了一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质，并公开了其具体的结构。本发明专利技术还公开了该蛋白质的应用及制备方法。本发明专利技术公开的蛋白质能同时抑制新生血管生长及抑制炎症反应，可通过双重作用机制，对老年性黄斑病变、糖尿病视网膜病变及翼状胬肉等眼科相关疾病具备一定的预防和缓解效果。此外，该蛋白质的提取纯化工艺相对简单，并且重复性强，成本低，利于工业化生产。而且和现有的抗新生血管生长药物康柏西普相比，动物实验结果显示，该蛋白质抑制角膜新生血管生长的效果比康柏西普强。
【技术实现步骤摘要】
一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质及其制备方法
本专利技术属于生物医药领域，特别是一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质及其制备方法。
技术介绍
临床上很多眼科疾病都与眼部组织发炎及病理性血管新生相关，包括但不限于湿性老年性黄斑病变、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎及结膜结缔组织增生(翼状胬肉)等。眼组织受到外部刺激或损伤后，会产生炎症反应，增加生长因子的释放修复受损组织。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是人体其中一种重要的生长因子，主要促进血管内皮细胞增生及形成新生血管。新血管生成是胚胎发育和伤口愈合过程中血管生长的主要机制。正常血管生成过程不仅包括内皮细胞迁移和增殖，还有血管成熟，血管重塑以及细胞外基质的降解等步骤。在正常条件下，由于血管生成因子如VEGF和色素上皮衍生因子(PEDF)的表达水平和功能的平衡，内皮细胞静止而且没有增殖。病理性的新血管生成明显不同于正常的血管，过量分泌的VEGF会诱导内皮细胞过度生长，快速形成不受控制的病理性新生血管。这些新生血管结构脆弱，容易出现出血和渗漏。此外，VEGF还会导致微血管壁内皮细胞形成间隙，增加血管的渗透性。如脉络膜出现病理性的新生血管增生，有机会侵犯视网膜，渗出的血液可能导致视网膜黄斑病变，病情严重的患者甚至会失去视力。如新生血管出现在结膜，则可能诱导病理性结膜组织增生。眼部炎症可能由外部刺激、感染或意外损伤引起，不同部位的炎症会引起不同的病变，包括角膜炎和葡萄膜炎等。有研究发现，长期的炎症刺激会增加VEGF的表达，加快病理性的血管新生。现今临床治疗新生血管相关的眼科疾病主要以针对清除VEGF的单克隆抗体为主。因此，同时具有抗炎生物活性的抑制新生血管药物能提供更好的疗效。因鉴于此，特提出此专利技术。
技术实现思路
现有针对新生血管的药物治疗以封闭血管渗漏及抑制新生血管生长为主，临床治疗药物主要有针对VEGF的单克隆抗体，虽然单克隆抗体药物具有一定疗效，但也具有干扰免疫系统，诱导系统性炎症反应的风险。而且，单克隆抗体药物的分子量大，结构复杂，不容易存储，更重要的是对生产技术及生产环境的要求很高，造成单克隆抗体药物的价格相对较高。对此，本专利技术提供了一种蛋白质，编号为ZK002，具有抑制新生血管生成及抗炎生物活性，同时制备工艺简单，成本较低，利于工业化生产。首先，本专利技术提供了一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质，其编号为ZK002，所述蛋白质采用非还原性SDS-PAGE(非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定的分子量为25000-35000道尔顿，所述蛋白质的分子由α链和β链组成，α链的蛋白序列如SEQIDNo.1所示，β链的蛋白序列如SEQIDNo.2所示；所述蛋白质具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性。该蛋白质采用还原性SDS-PAGE(还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳)法测定的α链分子量为12000-22000道尔顿，β链的分子量为9000-19000道尔顿。晶体结构观察发现蛋白分子内存在6对链内二硫键(α链和β链各有3对)和1对链间二硫键。进一步的，本专利技术还公开了该蛋白质在抑制新生血管生成和抑制炎症反应方面的应用，以及在药物组合物中的应用。进一步的，药物组合物中还包括药学可接受的载体或药学可接受的赋形剂和/或稳定剂。更进一步的，本专利技术公开了一种上述蛋白质ZK002的制备方法，依次按以下步骤进行：(1)将尖吻蝮蛇蛇毒用Tris-HCl缓冲液溶解，离心收集上清液；(2)将步骤(1)得到上清液通过已充分平衡的阴离子交换层析柱进行吸附，吸附完成后用A液洗脱未被吸附的杂蛋白，A液洗脱完成后用B液进行梯度洗脱，用分部收集器收集B液洗脱产物，并同时使用紫外检测器在280nm处检测追踪各组分峰值；本步骤中所述A液为pH7.0-9.0的0.01-0.1mol/LTris-HCl溶液，B液为pH6.0-9.0的0.01-0.05mol/LTris-HCl和0.05-0.6mol/LNaCl的混合溶液；(3)将步骤(2)中收集的目的蛋白洗脱产物用截留分子量3000-10000Da的膜包进行超滤浓缩，将浓缩后的产物用已充分平衡好的阳离子交换层析柱进行吸附，吸附完成后用C液洗脱未被吸附的杂蛋白，C液洗脱完成后用D液进行梯度洗脱，用分部收集器收集D液洗脱产物，并同时使用紫外检测器在280nm处检测追踪各组分峰值；本步骤中C液为pH6.0-9.0的0.01-0.1mol/LTris-HCl溶液，D液为pH7.0-9.0的0.01-0.06mol/LTris-HCl和0.05-0.6mol/LNaCl的混合溶液；(4)将步骤(3)中收集目的蛋白洗脱产物用截留分子量3000-10000Da的膜包进行超滤浓缩，将浓缩后的产物用亲和层析柱吸附，吸附完成后用平衡缓冲液平衡，再用Gly缓冲液洗脱，收集Gly洗脱峰对应的洗脱产物，用NaOH将该洗脱产物的pH调节至6.0-9.0本步骤中平衡缓冲液为pH6.0-9.0的0.01-0.1mol/LTris-HCl和0.05-0.5mol/LNaCl的混合溶液，Gly缓冲液为0.1-0.5mol/LGly，PH2.0-4.0；(5)将步骤(4)中收集的经pH调整的Gly洗脱峰的洗脱产物用截留分子量3000-10000Da的滤膜进行超滤浓缩，将浓缩后的产物用凝胶层析柱吸附，吸附完成后用E液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱产物即为纯化后的蛋白质产品；本步骤中E液为pH6.0-9.0的0.01-0.1mol/LMTris-HCl和0.05-0.5mol/LNaCl的混合溶液。优选的，步骤(1)中所用的Tris-HCl缓冲液的pH为7.0-9.0，浓度为0.01-0.1mol/L。优选的，步骤(1)中溶解温度为4℃，溶解时间为6-12h。优选的，步骤(1)中离心工艺为4000r/min离心两次，每次10min。优选的，步骤(2)中上清液吸附工艺的流速为50mL/min。优选的，步骤(2)A液洗脱流速为48mL/min，洗脱时间为600min；B液洗脱流速为43mL/min。优选的，步骤(3)中吸附工艺的流速为5mL/min。优选的，步骤(3)中C液洗脱流速为5.5mL/min，洗脱时间为300min；D液洗脱流速为5.5mL/min。优选的，步骤(4)中平衡缓冲液洗脱的流速为0.5mL/min。优选的，步骤(5)中吸附工艺的流速为2.0mL/min。优选的，步骤(5)中E液洗脱流速为0.3mL/min。相比于现有技术，本专利技术的优点在于：本专利技术公开的天然蛋白ZK002的能同时抑制新生血管生长及抑制炎症反应，可通过双重作用机制，对老年性黄斑病变、糖尿病视网膜病变及翼状胬肉等眼科相关疾病具备一定的预防和缓解效果。此外，ZK002的提取纯化工艺相对简单，并且重复性强，成本低，利于工业化生产。且和现有的抗新生血管药物康柏西普相比本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质采用非还原性SDS-PAGE(非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定的分子量为25000-35000道尔顿，所述蛋白质的分子由α链和β链组成，α链的蛋白序列如SEQ ID No.1所示，β链的蛋白序列如SEQ ID No.2所示；所述蛋白质具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性。/n
【技术特征摘要】
20201211 CN 20201145286721.一种具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质采用非还原性SDS-PAGE(非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定的分子量为25000-35000道尔顿，所述蛋白质的分子由α链和β链组成，α链的蛋白序列如SEQIDNo.1所示，β链的蛋白序列如SEQIDNo.2所示；所述蛋白质具有抑制新生血管生长及抑制炎症反应活性。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，采用还原性SDS-PAGE(还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳)法测定的α链分子量为12000-22000道尔顿，β链的分子量为9000-19000道尔顿。
3.权利要求1-2中任一所述的蛋白质在抑制新生血管生成和抑制炎症反应方面的应用。
4.权利要求1-2中任一所述的蛋白质在药物组合物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学可接受的载体或药学可接受的赋形剂和/或稳定剂。
6.一种权利要求1-2中任一所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，依次按以下步骤进行：
(1)将尖吻蝮蛇蛇毒用Tris-HCl缓冲液溶解，离心收集上清液；
(2)将步骤(1)得到上清液通过已充分平衡的阴离子交换层析柱进行吸附，吸附完成后用A液洗脱未被吸附的杂蛋白，A液洗脱完成后用B液进行梯度洗脱，用分部收集器收集B液洗脱产物，并同时使用紫外检测器在280nm处检测追踪各组分峰值；本步骤中所述A液为pH7.0-9.0的0.01-0.1mol/LTris-HCl溶液，B液为pH6.0-9.0的0.01-0.05mol/LTris-HCl和0.05-0.6mol/LNaCl的混合溶液；
(3)将步骤(2)中收集的目的蛋白洗脱产物用截留分子量3000-10000Da的膜包进行超滤浓缩，将浓缩后的产物用已充分平衡好的阳离子交换层析柱进行吸附，吸附完成后用C液洗脱未被吸附的杂蛋白，C液洗脱完成后用D液进行梯度洗脱，用分部收集器收集D液洗脱产物，并同时使用紫外检测器在280nm处检测追踪各组分峰值；本步骤中C液为pH6.0-9.0的0.01-0.1mol/LTris-HCl溶液，D液为pH7.0-9.0的0.01-0.06mol/LTris-HCl和0.05-0.6mol/LNaCl的混合溶液；
(4)将步骤(3)中收集目的蛋白洗脱产物用截留分子量3000-10...
【专利技术属性】
技术研发人员：李小羿，戴向荣，方丽，钱芳，闫银萍，戴自城，李洛谊，
申请(专利权)人：兆科广州眼科药物有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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