一种FMOD拮抗多肽及其衍生物与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种FMOD拮抗多肽及其衍生物与应用，具体公开了一种FMOD拮抗多肽。所述FMOD拮抗多肽HL12‑FP1的氨基酸残基序列如SEQ ID No：1所示，Asp‑Tyr‑Thr‑Ala‑Pro‑Pro‑Ser‑Lys‑Phe‑Tyr‑Gly‑His SEQ ID No：1。该结合肽及其衍生物能结合FMOD，通过与FMOD的结合阻断其下游信号通路从而抑制结直肠癌的细胞的增殖、迁移和侵袭，为结直肠癌等提供有效的治疗小分子药物，能够在医学与生物学领域得到广泛的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种FMOD拮抗多肽及其衍生物与应用
本专利技术涉及生物技术和生物医药领域，具体而言，涉及结直肠癌靶点FMOD受体拮抗多肽HL12-FP1及其衍生物与应用。
技术介绍
1.1结直肠癌结直肠癌作为最常见的恶行肿瘤之一，每年占据了癌症确诊率的10％。根据流行病学报告表明，结直肠癌的死亡率位列第四，位于肺癌、肝癌和胃癌之后。从1990年到2017年，全球结直肠癌的年龄标准化发病率增加了9.5％，而结直肠癌筛查措施的引入使得死亡率下降了13.5％。但是中国的中国的结直肠癌发病率和死亡率增幅都明显高于世界平均水平，中国结直肠癌发病数分别为10.7万和43.2万，发病率升高了84.1％。中国结直肠癌死亡数分别为7.6万和18.7万，死亡率升高了8.2％，而结直肠癌已经增长为中国的第三大癌症。目前结直肠癌的病因尚未完全明确，但是伴随着医学及分子生物学的不断发展及研究的日益深入，结直肠癌的病变过程可归纳为三种类型，其中染色体不稳定是主要的病变类型，基因APC的突变引起RAS激活和TP53丢失造成结直肠癌的形成。遗传和环境因素对结直肠癌的发生均具有重要的影响。日常生活中吸烟、饮酒过量，体重增加，以及红类和加工肉类的摄入会加速结直肠癌的发生结直肠癌的治疗方法主要以内镜治疗、外科手术、放射疗法、化学疗法等为主，其中外科手术为结直肠癌治疗的基础和主要手段。但是仅适用于早期阶段，对于中晚期患者，手术治疗效果不佳。所以其他新兴的治疗方式：靶向治疗、基因治疗、新辅助化疗、免疫治疗等治疗手段也越来越多的被应用。分子靶向药物治疗在特定患者中疗效显著，患者生存获益。但靶向药物的应用存在局限性，主要因为目前靶向药物的有效的靶点还较少，同时在选择适宜的靶向治疗药物前，需要对患者进行相应的分子靶点检测。目前针对CRC患者，主要的两种靶向药物是以血管内皮生长因子(VEGF)为靶点的贝伐珠单抗和以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的西妥昔单抗。国内学者研究提示，进展期及晚期结直肠癌患者使用西妥昔单抗和贝伐珠单抗生存获益。1.2FMOD与结直肠癌FMOD中文名为纤调蛋白，属于富含亮氨酸重复序列蛋白聚糖家族(small-leucine-rich-proteoglycan，SLRP)。SLRP共包含了18种蛋白成员，根N末端富含半胱氨酸簇的空间结构，C末端富含半胱氨酸簇基序，基因在染色体上的分布位点划分为五类。其中FMOD的基因定位于1q32，编码的蛋白为大小59kDa的分泌型细胞外基质，归于SLRP第二类成员。作为细胞外基质的重要组成部分，FMOD参与多种生物学过程，例如：血管生成、细胞凋亡以及迁移侵袭。大量研究发现FMOD能够直接作用于TGF-β，并且局部调节该生长因子在局部基质中的功能作用。TGF-beta是一种重要的多功能细胞因子，大量临床数据表明它和肿瘤不良预后有重要关系，被认为是肿瘤发展过程中的重要因素。在正常组织中，FMOD是一种重要的血管生成因子，增强ANG2andVEGF的表达，抑制ANG1的生成，从而促进伤口愈合以及血管再生。小细胞肺癌中是一种侵袭能力极高的恶性肿瘤，有研究发现FMOD在小细胞肺癌中出现异常表达，并且参与肿瘤血管的形成。同时在前列腺癌中，FMOD可能是一种潜在的肿瘤标志物。在结直肠癌中，从细胞和临床水平发现FMOD有高表达的趋势。1.3噬菌体展示技术噬菌体展示技术(phagedisplaytechnology)是由Smith等人于1985年提出，并于1989年成功构建。噬菌体展示是一种选择技术，将多肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合并展示在病毒粒子表面。噬菌体显示随机多肽库能够对多肽进行功能访问，并在显型(显示的肽)和基因型(编码DNA)之间提供物理连接；这些库可用于筛选过程中，结合克隆从非结合克隆通过亲和纯化分离。噬菌体展示技术的原理，是将一段外源基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正常且不影响外壳蛋白正常功能的情况下，外源基因会随着外壳蛋白的表达而表达，从而使多肽或蛋白以融合蛋白的形式展现在噬菌体表面。被展示的蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，有利于靶蛋白的结合，因而可以利用靶蛋白快速的进行噬菌体展示文库的筛选。在展示文库构建完成后，以靶蛋白为固定相，和展示文库共同孵育一段时间，洗去未结合噬菌体，再以竞争受体洗脱吸附的噬菌体。洗脱得到的噬菌体感染宿主菌繁殖扩增，然后进行下一轮洗脱。经过3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后(对于某些亲和力弱的抗体需经过更多轮的洗脱)，便可以得到能与靶蛋白特异性结合的噬菌体的高度富集。该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。噬菌体展示技术适合用于全人源抗体药物的制备。治疗类风湿关节炎的抗肿瘤坏死因子α的Humira是第一个应用噬菌体抗体库技术生产的并被美国食品药品管理局批准的全人源抗体药物。到2014为止，被美国食品药品管理局批准的应用噬菌体抗体库技术生产的抗体有6个，且同时有30种以上的相关药物处于临床试验阶段。除筛选制备型抗体外，噬菌体抗体库技术也能被用于筛选相应抗原。因此，噬菌体展示技术抗体库因其具有的高库容、高效方便以及灵活筛选等优势，在生命科学的许多领域得到广泛应用，尤其在肿瘤诊断和肿瘤抗体药物制备等领域正越来越受到的重视。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种FMOD拮抗多肽，该拮抗多肽与受体FMOD具有特异性高亲和力，能够通过与FMOD的结合来阻断FMOD的信号通路，证明该多肽在靶向抑制结直肠癌细胞增殖和迁移促进结直肠癌细胞凋亡等方面起着重要的作用，其在结直肠癌靶向治疗方面具有巨大的应用价值。本专利技术的另一目的在于提供上述FMOD受体拮抗多肽的衍生物，该衍生物也能够与FMOD受体具有特异性高亲和力，且特异性与FMOD结合。本专利技术的再一目的在于提供上述FMOD拮抗多肽及其衍生物的应用。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：本专利技术一个方面提供了一种FMOD拮抗多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo：1所示，Asp-Tyr-Thr-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Phe-Tyr-Gly-HisSEQIDNo：1。上述FMOD拮抗多肽的筛选方法，该方法利用噬菌体随机肽库，首先采用FMOD质粒转染293T细胞，获得永久高表达FMOD的稳定细胞系，以野生型293T细胞为对照吸附细胞，进行5轮全细胞消减筛选，随机挑取60个阳性噬菌体扩增，提取克隆单链DNA测序。分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同源性比较，检索出现频率高的多肽基序。本专利技术另一个方面提供了一种FMOD拮抗多肽的衍生物，所述的FMOD拮抗多肽的衍生物为FMOD拮抗多肽氨基酸侧链基团上、FMOD拮抗多肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为FMOD拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；所述的常规修饰优选为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种FMOD拮抗多肽，其特征在于：所述FMOD拮抗多肽的氨基酸残基序列如SEQ IDNo：1所示，/nAsp-Tyr-Thr-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Phe-Tyr-Gly-His SEQ ID No：1。/n

【技术特征摘要】
1.一种FMOD拮抗多肽，其特征在于：所述FMOD拮抗多肽的氨基酸残基序列如SEQIDNo：1所示，
Asp-Tyr-Thr-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Phe-Tyr-Gly-HisSEQIDNo：1。


2.一种权利要求1所述的FMOD拮抗多肽的衍生物，其特征在于：
所述的FMOD拮抗多肽的衍生物为权利要求1所述的FMOD拮抗多肽氨基酸侧链基团上、权利要求1所述的FMOD拮抗多肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为权利要求1所述的FMOD拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；
所述的常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰；
所述的标签为His、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact。


3.一种多聚核苷酸，其编码权利要求1所述的FMOD拮抗多肽或权利要求2所述的衍生物。


4.一种载体，其包含了权利要求3所述的多聚核苷酸。


5.一种宿主细胞，其转染了权利要求4所述的载体。...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄来强，邓婷，代小勇，王丽君，林高扬，董璐，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44