蜂王浆新鲜度的生物标记物及其筛选方法技术

本发明专利技术提供一种蜂王浆新鲜度的生物标记物及其筛选方法。使用蛋白质组学分析平台，和超高效液相色谱串联飞行时间质谱，基于TQMS仪器分析，得到同时具备高易酶解性与高酶解后稳定性的候选MRJPs多肽。生物标记物包括：MRJP1的特异性标志多肽：YNGVPSSLNVISK，SEQ ID NO：1；MRJP2的特异性标志多肽：TLQMIAGMK，SEQ ID NO：2；MRJP 3的特异性标志多肽：LTVAGESFTVK，SEQ ID NO：3。本发明专利技术具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于体现蜂王浆整体生物活性的新鲜度检测，尤其适用于蜂王浆原料和产品质量控制。该方法对规范蜂王浆质量评价，尤其是未来蜂王浆主蛋白产品市场的开拓，蜂王浆产业的健康发展具有重要现实意义。

Biomarker for freshness of royal jelly and its screening method

【技术实现步骤摘要】
蜂王浆新鲜度的生物标记物及其筛选方法
本专利技术涉及蜂王浆新鲜度的生物标记物及其筛选方法。
技术介绍
蜂王浆和蜂蜜是两种深受欢迎的蜂产品。蜂王浆，又称王浆和蜂乳，是由5~15日龄工蜂头部营养腺（包括脑后腺、咽下腺和上颚腺等）分泌的特殊白色乳状物质。蜂王浆是蜂王和3日龄内工蜂幼虫的专用食料，是决定蜜蜂雌性幼虫发育成为蜂王还是工蜂的关键食物因素。作为一种营养保健品，蜂王浆的活性和功能很多，显然其功能与其所含的生物活性成分有关，已知其主要成分包括蛋白质、碳水化合物、脂类和王浆酸等。近年来相关研究表明，蜂王浆中的主要生物活性在常温下会随储存时间下降，极易变质而失去营养功能。迄今为止十羟基葵烯酸（王浆酸，10-HDA）含量是目前我国和国际蜂王浆标准中衡量品质优劣的主要指标（GB9697-2008蜂王浆）。然而研究显示，在长期储存过程中，蜂王浆中的10-HDA含量非常稳定，并不适合作为代表蜂王浆新鲜度的指标[AntinelliJF，ZegganeS，RenéeDavico，etal.Evaluationof(E)-10-hydroxydec-2-enoicacidasafreshnessparameterforroyaljelly[J].FoodChemistry，2003，80(1):85-89]，因此亟需完善的蜂王浆质量评价体系。蛋白质是蜂王浆中的主要活性物质，占王浆干重的30~50%，其中由9个成员（MRJP1~9）组成的糖基化蛋白家族—王浆主蛋白（Majorroyaljellyproteins，缩写MRJPs）占王浆中可溶性蛋白含量的90%左右。在常温下储存过程中，由于蜂王浆中内源性酶等的作用，蛋白质随会随着储存时间的推移而降解，引起蛋白质结构的改变和含量的下降。现有蜂王浆新鲜检测技术主要是由沈立荣团队研发的，基于对单一蜂王浆主蛋白成员——王浆主蛋白1（MRJP1）特异性蛋白标志物MRJP1含量进行检测的聚丙烯酰胺电泳法（SDS-PAGE）和间接酶联免疫测定法（ELISA）[ShenLi-rongetal.DeterminationofroyaljellyfreshnessbyELISAwithahighlyspecificanti-apalbumin1，majorroyaljellyprotein1antibody[J].JournalofZhejiangUniversity-SCIENCEB，2015，16(2):155-166]，并申请专利技术专利-电泳胶蛋白条带检测蜂王浆新鲜度的建立方法和应用（申请号:201410554252.9）。这些方法能通过蜂王浆中MRJP1随时间的降解程度分析，对蜂王浆的新鲜度做出快速判断。然而，由于ELISA法的开发需要利用动物制备特异性抗体，周期长，成本高且重现性不高；而SDS-PAGE法的只能根据电泳图像的蛋白条带灰度作初步的含量差别判断，特异性较低，定量能力差，均不适合作为标准化的精准定性定量分析方法。近年来，胡菡等制备了利用王浆主蛋白3-MRJP3为抗原的单克隆抗体，申报了可检测MRJP3含量的酶标仪（ELISA）快速检测方法及试剂盒（胡菡，李建科，冯毛，房宇，韩宾.抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体及检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒.2018年，CN107892713A）。与上述传统分析方法相比，基于高选择性和特异性的选择离子监测模式和精确的定量能力，LC-MS是当今蛋白质组学研究的最重要的技术手段之一，在食品特定蛋白质定量检测上受到广泛的应用[陈启，赖世云，张京顺，任一平.利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱定量检测人乳中的α-乳白蛋白.食品安全质量检测学报，2014，(5):2095-2100；胡蓓，张京顺，柯星，蒋易蓉，周健，果基施锑，任一平.高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量.食品科学，2018，(39):286-291]。2018年，浙江工商大学傅玲莉等在报道了采用液相色谱串联质谱方法，筛选了采用单一王浆主蛋白：MRJP1的特异性多肽“FFDYDFGSDER”为标记物检测MRJP1含量，作为判断蜂王浆掺假或者质量优劣的方法[NaLin，SiChen，HongZhang，JunminLi，LinglinFu.Quantificationofmajorroyaljellyprotein1infreshroyaljellybyultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry.JournalofAgriculturalandFoodChemistry.66(5):1270-1278]。但蜂王浆主蛋白是一组需要通过整体协同作用，发挥生物活性的功能蛋白，特别是主蛋白MRJP1~5均属于糖基化蛋白，占王浆主蛋白总量的80%以上（Schmitzova´，J，Klaudiny，J，Albert，S.，Schroder，W，Schreckengost，W，Hanes，J，Judova，J.&Simuth，J.1998.AfamilyofmajorroyaljellyproteinsofthehoneybeeApismelliferaL.CellularandMolecularLifeSciences54，1020–1030），王浆的促进生育和抗衰老功能是主蛋白的整体协同作用（AjithaNathKoomankode，GanapathiRamanathana.，AnanthaKrishnan，JayakumaranNaira，VethaSundaramSugunanb.Areviewonroyaljellyproteinsandpeptides.JournalofFunctionalFoods44(2018)255-264），而以往的论文和专利技术专利检测蜂王浆的新鲜度基本是以某种单一主蛋白含量为主要目标，缺乏多种蛋白组合的综合性评价方法检测方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供蜂王浆新鲜度的生物标记物及其筛选方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于蛋白质组学的体现蜂王浆新鲜度的生物标记物的筛选方法，1）预处理：将蜂王浆样品经DTT、IAA溶液预处理后，用重组牛胰蛋白酶酶解，得到王浆主蛋白（Majorroyaljellyproteins,MRJPs）的多肽溶液；2）数据分析：使用ProteinLynxGlobalServer（PLGS）蛋白质组学分析平台，将经超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）检测出的MRJPs多肽序列信息与从UniProt蛋白质数据库（www.uniprot.org）获取的MRJPs多肽序列理论信息比对分析，得到王浆粗蛋白酶解产物中MRJPs多肽的鉴别结果；将经UPLC-Q-TOF/MS质谱分析得到MRJPs多肽参数导入超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UPLC-TQMS）仪器中，建立候选多肽的定量MRM分析方法，经检测得到69条候选多肽；3）特征多肽筛选：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蜂王浆新鲜度的生物标记物的筛选方法，其特征在于：/n1）预处理：将蜂王浆样品经DTT、IAA溶液预处理后，用重组牛胰蛋白酶酶解，得到王浆主蛋白（Major royal jelly proteins, MRJPs）的多肽溶液；/n2）数据分析：使用ProteinLynx Global Server（PLGS）蛋白质组学分析平台，将经超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）检测出的MRJPs多肽序列信息与从UniProt蛋白质数据库（www.uniprot.org）获取的MRJPs多肽序列理论信息比对分析，得到王浆粗蛋白酶解产物中MRJPs多肽的鉴别结果；将经UPLC-Q-TOF/MS质谱分析得到MRJPs多肽参数导入超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UPLC-TQMS）仪器中，建立候选多肽的定量MRM分析方法，经检测得到69条候选多肽；/n3）特征多肽筛选：基于TQMS仪器分析，对69条候选多肽作重复检测，初步剔除35条峰面积低于2000的低含量多肽；/n建立MRJPs候选多肽的酶解时间与酶解程度的热力分析图，进一步筛选出同时具备高易酶解性与高酶解后稳定性的候选MRJPs多肽；高易酶解性多肽的标准是候选多肽的相对峰面积比值能在酶解2 h内达到90％以上，高酶解后多肽稳定性的标准是候选多肽的相对峰面积比值在酶解24 h后不小于70％；剔除候选多肽中的非特异性多肽，得到15条MRJPs候选多肽；/n基于2小时最佳酶解时间和高响应值，从15条候选多肽中分别筛选出1条MRJP1、MRJP2、MRJP 3的最佳候选多肽：/nMRJP1的特异性标志多肽：YNGVPSSLNVISK，SEQ ID NO：1；/nMRJP2的特异性标志多肽：TLQMIAGMK，SEQ ID NO：2；/nMRJP 3的特异性标志多肽：LTVAGESFTVK，SEQ ID NO：3。/n...

【技术特征摘要】
1.一种蜂王浆新鲜度的生物标记物的筛选方法，其特征在于：
1）预处理：将蜂王浆样品经DTT、IAA溶液预处理后，用重组牛胰蛋白酶酶解，得到王浆主蛋白（Majorroyaljellyproteins,MRJPs）的多肽溶液；
2）数据分析：使用ProteinLynxGlobalServer（PLGS）蛋白质组学分析平台，将经超高效液相色谱串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）检测出的MRJPs多肽序列信息与从UniProt蛋白质数据库（www.uniprot.org）获取的MRJPs多肽序列理论信息比对分析，得到王浆粗蛋白酶解产物中MRJPs多肽的鉴别结果；将经UPLC-Q-TOF/MS质谱分析得到MRJPs多肽参数导入超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UPLC-TQMS）仪器中，建立候选多肽的定量MRM分析方法，经检测得到69条候选多肽；
3）特征多肽筛选：基于TQMS仪器分析，对69条候选多肽作重复检测，初步剔除35条峰面积低于2000的低含量多肽；
建立MRJPs候选多肽的酶解时间与酶解程度的热力分析图，进一步筛选出同时具备高易酶解性与高酶解后稳定性的候选MRJPs多肽；高易酶解性多肽的标准是候选多肽的相对峰面积比值能在酶解2h内达到90％以上，高酶解后多肽稳定性的标准是候选多肽的相对峰面积比值在酶解24h后不小于70％；剔除候选多肽中的非特异性多肽，得到15条MRJPs候选多肽；
基于2小时最佳酶解时...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈立荣，江唯健，沈昊来，丁晨，
申请(专利权)人：杭州艾蜂健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33