基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂及方法技术

基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂及方法，试剂由巯基和氨基分别修饰两端的C反应蛋白核酸适配体与羧基化量子点和纳米金颗粒结合后形成的生物探针，和C反应蛋白核酸适配体的小段互补DNA链构成；检测方法是先将多个已知浓度的C反应蛋白标准溶液和生物探针混合并静置孵育，然后检测混合溶液一定波长激发光照射下的发射荧光光谱，以C反应蛋白标准液浓度为横坐标，检测得到的荧光强度值作为纵坐标，绘制荧光强度与C反应蛋白浓度的线性关系曲线；最后检测待测样品中的荧光强度，带入线性关系曲线中，得到待测样品的C反应蛋白浓度；本发明专利技术具有检测时间短，检测精度高，检测流程简单等优点。

【技术实现步骤摘要】
基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂及方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白荧光检测方法。
技术介绍
C反应蛋白是人体血浆中发现的一种环状五聚体蛋白，当人体组织受到损伤或微生物入侵等炎症刺激时，肝细胞会合成大量的C反应蛋白，使其浓度高于正常水平的数十倍甚至上百倍。研究表明，人体血清中的C反应蛋白在细菌性感染6到8小时左右就开始升高，相较于白细胞反应更加迅速，24至48小时浓度可达到峰值。随着感染因素去除，C反应蛋白水平随之下降。因此，C反应蛋白水平已被作为判断急性呼吸道感染，肠道感染等感染性疾病的重要指标。不仅如此，目前C反应蛋白也是急性心肌梗死的重要生物标志物之一，在心梗患者发病初期C反应蛋白水平会急剧升高，美国疾病控制与预防中心表明，血清中C反应蛋白水平可作为判断心血管疾病患者病情危险性的依据。由于C反应蛋白水平的变化往往伴随着急性炎症、感染甚至是心机梗死等威胁病人生命的突发性疾病，且其浓度随病人病情变化剧烈，因此，对C反应蛋白的快速，精确检测对临床诊断和病人生命健康有着重大意义。正常人体血清中的C反应蛋白浓度通常小于1μg/mL，目前临床上使用最为广泛的C反应蛋白检测方法是酶联免疫吸附测定法，利用传统的双抗夹心原理和酶的催化效应可以极大的放大检测信号，从而可以得到较高的检测精度。然而这种检测方法通常需要5至10小时的检测时间，对于突发性疾病患者来说，检测结果的时效性至关重要。近年来，许多科学家也致力于研究对C反应蛋白的快速检测方法，包括电化学检测法，场效应晶体管法，表面增强拉曼散射法等。但这些方法往往需要繁琐的检测步骤和复杂的信号读出设备，对于检测人员的专业技能和检测设备条件要求较高，不适合应用于临床检测。核酸适配体是一段具有识别功能的单链DNA或RNA序列，作为一种新兴的生物识别敏感单元，相较于传统抗体有着不可比拟的优势。其亲和力高，特异性好，检测生物分子种类广泛，酸碱环境兼容性好，对存储条件要求低，价格更是远低于抗体。因此，核酸适配体在生物标志物的快速灵敏检测方面有着巨大的应用潜力。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供了基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂及方法，实现对C反应蛋白的快速、灵敏检测，具有检测时间短，检测精度高，检测流程简单等优点。为了达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂，由巯基和氨基分别修饰两端的C反应蛋白核酸适配体与羧基化量子点和纳米金颗粒结合后形成的生物探针，和C反应蛋白核酸适配体的一小段互补DNA链构成。所述的巯基和氨基修饰两端的C反应蛋白核酸适配体的DNA序列为:5’-C6-NH2-CGAAGGGGATTCGAGGGGTGATTGCGTGCTCCATTTGGTG-SH-C6-3’；所述的该核酸适配体的一小段互补DNA链序列为：5’-CTCGAATCCCCTTCG-3’。所述的巯基和氨基分别修饰两端的C反应蛋白核酸适配体与羧基化量子点和纳米金颗粒结合后形成的生物探针的制备方法，包括以下步骤：(1)将等体积的100μMC反应蛋白核酸适配体与20mM三(2-羧乙基)膦混合并在室温下孵育30分钟以还原二硫键，得到第一混合溶液；(2)将纳米金溶液与第一混合溶液混合，使得纳米金与C反应蛋白核酸适配体的比例为1:1-1:500，比例根据纳米金大小调整，并加入1M氯化钠溶液至氯化钠的浓度为50mM，室温下振荡1h后再次加入1M氯化钠溶液至氯化钠的浓度为100mM，重复上述操作至氯化钠最终浓度达到300mM；室温下孵育过夜，使得C反应蛋白核酸适配体与纳米金颗粒结合，得到第二混合溶液；(3)将第二混合溶液经离心除去上层透明溶液，并将底部深红色沉淀分散于超纯水中，重复清洗，得到纳米金修饰的C反应蛋白核酸适配体；(4)将羧基化量子点用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活后与纳米金修饰的C反应蛋白核酸适配体混合并搅拌得到第三混合溶液；(5)将第三混合溶液与C反应蛋白核酸适配体的小段互补DNA链混合并搅拌，使得C反应蛋白核酸适配体与该核酸适配体的小段互补DNA链浓度比为1:1，得到第四混合溶液；(6)将第四混合溶液用超滤离心管离心过滤后清洗三次以上，得到巯基和氨基分别修饰两端的C反应蛋白核酸适配体与羧基化量子点和纳米金颗粒结合后形成的生物探针。所述的纳米金溶液的制备方法为：将100mLHAuCl4溶液加热至80℃回流并搅拌，随后加入10mL38.8mM柠檬酸钠溶液后搅拌至溶液变成深红色。利用一种基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂的检测方法，包括以下步骤：(1)将多个已知浓度的C反应蛋白标准溶液和C反应蛋白核酸适配体和羧基化量子点与纳米金颗粒结合后形成的生物探针混合至1mL并静置孵育，得到第五混合溶液；(2)检测第五混合溶液一定波长激发光照射下的发射荧光光谱，以C反应蛋白标准液浓度为横坐标，检测得到的荧光强度值作为纵坐标，绘制荧光强度与C反应蛋白浓度的线性关系曲线；(3)以步骤(1)和步骤(2)的方法检测待测样品中的C反应蛋白浓度，将测得的荧光强度带入步骤(2)的线性关系曲线中即得到待测样的C反应蛋白浓度。所述的一定波长激发光的波长为量子点的激发波长。所述的荧光强度值是发射荧光光谱峰值处的荧光强度。本专利技术的原理为：本专利技术检测方法基于荧光共振能量转移(FRET)效应，该效应取决于FRET供体-受体对之间的距离。量子点是一种纳米级的零维半导体，通过对这种纳米半导体材料施加一定激发光，它们便会发出特定频率的荧光。在本专利技术中，量子点作为供体，纳米金作为受体，当两者距离较远时，量子点在激发状态下可以发出荧光；当两者距离足够近时，量子点与纳米金之间会发生电子转移，从而导致量子点的荧光淬灭。当C反应蛋白核酸适配体和羧基化量子点与纳米金颗粒结合后形成的生物探针遇到被测样品中的C反应蛋白，C反应蛋白核酸适配体与C反应蛋白结合时会导致其二级结构发生变化，也就导致了C反应蛋白核酸适配体两端的供体量子点和受体纳米金之间的距离缩短，因此量子点发出的荧光也会产生淬灭而降低；引入C反应蛋白核酸适配体的小段互补DNA链的作用是通过互补DNA拉伸C反应蛋白核酸适配体上的环状结构，使得量子点和纳米金之间的初始距离最大化，从而得到更大的荧光强度变化。当C反应蛋白出现后，由于C反应蛋白核酸适配体与C反应蛋白间具有更强的亲和力，该核酸适配体会脱离互补DNA与C反应蛋白结合；通过检测该生物探针的荧光变化，可以推断得到C反应蛋白的浓度大小。本专利技术提出的检测方法的有益效果为：(1)本专利技术利用了C反应蛋白核酸适配体既作为生物分子敏感单元，又作为FRET供体-受体对之间的“纳米尺”，通过C反应蛋白核酸适配体结合靶标前后的二级结构变化引起的量子点荧光强度的变化检测靶标浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂，其特征在于：由巯基和氨基分别修饰两端的C反应蛋白核酸适配体与羧基化量子点和纳米金颗粒结合后形成的生物探针，和C反应蛋白核酸适配体的一小段互补DNA链构成。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂，其特征在于：由巯基和氨基分别修饰两端的C反应蛋白核酸适配体与羧基化量子点和纳米金颗粒结合后形成的生物探针，和C反应蛋白核酸适配体的一小段互补DNA链构成。


2.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂，其特征在于：所述的巯基和氨基修饰两端的C反应蛋白核酸适配体的DNA序列为:5’-C6-NH2-CGAAGGGGATTCGAGGGGTGATTGCGTGCTCCATTTGGTG-SH-C6-3’；所述的该核酸适配体的一小段互补DNA链序列为：5’-CTCGAATCCCCTTCG-3’。


3.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂的巯基和氨基分别修饰两端的C反应蛋白核酸适配体与羧基化量子点和纳米金颗粒结合后形成的生物探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将等体积的100μMC反应蛋白核酸适配体与20mM三(2-羧乙基)膦混合并在室温下孵育30分钟以还原二硫键，得到第一混合溶液；
(2)将纳米金溶液与第一混合溶液混合，使得纳米金与C反应蛋白核酸适配体的比例为1:1-1:500，比例根据纳米金大小调整，并加入1M氯化钠溶液至氯化钠的浓度为50mM，室温下振荡1h后再次加入1M氯化钠溶液至氯化钠的浓度为100mM，重复上述操作至氯化钠最终浓度达到300mM；室温下孵育过夜，使得C反应蛋白核酸适配体与纳米金颗粒结合，得到第二混合溶液；
(3)将第二混合溶液经离心除去上层透明溶液，并将底部深红色沉淀分散于超纯水中，重复清洗，得到纳米金修饰的C反应蛋白核酸适配体；
(4)将羧基化量子点用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活后与纳米金修饰的C反应蛋白核酸适配体混合并搅拌得到第三混合溶液；
(5)将第三混合溶液与C反应蛋白核酸适配体的小段互补DNA链混合并搅拌，使得C反应蛋白核酸适配体与该核酸适配体的小段互补DNA链浓度比为1:1，得到第四混合溶液；
(6)将第四混合溶液用超滤离心管离心过滤后清洗三次以上，得到巯基和氨基分别修饰两端的C反应蛋白核酸适配体与羧基化量子点和纳米金颗粒结合后形成的生物探针。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的纳米金溶液的制备方法为：将100mLHAuCl4溶液加热至80℃回流并搅拌，随后加入10mL38.8mM柠檬酸钠溶液后搅拌至溶液变成深红色。


5.利用权利要求1所述的一种基于核酸适配体和量子点淬灭效应的C反应蛋白检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将多个已知浓度的C反应蛋白标准溶液和C反应蛋白核酸适配体和羧基化量子点与纳米金颗粒结合后形成的生物探针混合至1mL并静置孵育，得到第五混合溶液；
(2)检测第五混合溶液一定波长激发光照射下的发射荧光光谱，以C反应蛋白标准液浓度为横坐标，检测得到的荧光强度值作为纵坐标，绘制荧光强度与C反应蛋白浓度的线性关系曲线；
(3)以步骤(1)和步骤(2)的方法检测待测样品中的C反应蛋白浓度，将测得的荧光强度带入步骤(2)的线性关系曲线中即得到待测样的C反应蛋白浓度。


6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述的一定波长激发光的波长为量子点的激发波长。


7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述的荧光强度值是发射荧光光谱峰值处的荧光强度。


8.一种基于核酸适配体和量子点淬灭效...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦学勇，陈轩，刘湘连，蒋庄德，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61