【技术实现步骤摘要】
一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA应用、挖掘及鉴定方法
本专利技术涉及猪脂肪沉积领域，具体涉及一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA应用、挖掘及功能鉴定方法。
技术介绍
我国地方猪种素有高繁殖性能和优良肉质而享誉世界，能够满足消费者对肉质的需求。但地方猪主要属于脂肪型，具有高背膘厚、低瘦肉率等特点。猪瘦肉率与背膘厚之间呈很强的负相关，而背膘厚较高、瘦肉率较低是制约地方猪养殖经济效益的重要经济性状，已不能适应现代消费市场和理念，且传统选育方法进展缓慢。畜禽育种目标是由市场和消费需求决定的，随着市场消费观念的转变，地方猪脂肪经济价值较低，如果能在保持其优良肉质与风味的同时，通过品种改良来降低脂肪厚度、提高瘦肉率将是地方猪开发利用和回归市场的主要途径。柯乐猪为我国优良品种之一，原产贵州赫章，以柯乐(今可乐)为中心产区，分布于贵州西北部和云南宣威、曲靖等地。毛色黑或棕黄，常有额白、尾尖白、四蹄白等特征。额部有明显的八卦型皱纹。具有抗寒、耐湿、耐粗饲料、早熟、易肥的特点。现有技术中，中国专利申请，申请号为：...
【技术保护点】
1.一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA，其特征在于，所述LncRNA名称为TCONS_00161198，其序列如SEQ ID.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种调控猪脂肪沉积性能的新LncRNA，其特征在于，所述LncRNA名称为TCONS_00161198，其序列如SEQID.1所示。
2.根据权利要求1所述新LncRNA的应用，其特征在于，所述新LncRNA在调控猪脂肪沉积中的应用。
3.根据权利要求1所述新LncRNA的应用，其特征在于，所述新LncRNA在预测猪肉胴体品质中的应用。
4.根据权利要求1所述新LncRNA的应用，其特征在于，所述新LncRNA在选育不同胴体品质猪中的应用。
5.根据权利要求1所述新LncRNA，其特征在于，所述的新LncRNA挖掘方法为：1)RNA的提取与检测；2)cDNA的合成；3)RNA-seq；4)LncRNA序列对比及分析；5)筛选差异表达LncRNA；6)LncRNA靶基因功能预测及分析；7)对筛选出的LncRNA进行进一步的筛选。
6.根据权利要求5所述新LncRNA，其特征在于，RNA的提取与检测方法为：
S1)利用液氮将需要使用的研钵预冷，分离组织至研钵中将其研磨成粉末状，取0.5～5g；
S2)将组织粉末移至有0.5～3mLTrizol的离心管中，混匀，室温静置2～8min；
S3)加入0.1-0.5mL氯仿，混匀，静置2～8min，2～6℃离心10～20min；
S4)将上清液转移至离心管中，加入0.2～0.8mL异丙醇，混匀，静置5～15min，2～6℃离心10～20min；
S5)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入65-80％乙醇，混合均匀，2～6℃离心2～8min；
S6)将步骤S5)重复一次；
S7)移去上清液后静置1～5分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-70～-85℃保存；
S8)RNA完整性检测：将2～8μLRNA与0.5～1.5μLRNALoadingbuffer混匀，取3～8μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V2～8min后紫外凝胶成像系统观察拍照；
S9)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-70～-85℃保存；
cDNA的合成方法为：从总RNA中去除核糖体RNA，随后将RNA打断成250～300bp的短片段，以片段化的RNA为模板，随机寡核苷酸为引物合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNApolymeraseI体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链，纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，筛选350～400bp的cDNA；
RNA-seq的方法为：使用USER酶降解含U的cDNA第二链，最后进行PCR扩增并获得文库；初步定量，稀释文库至1ng/ul；再检测对文库的插入片段长度insertsize进行检测，insertsize分布在250～300bp符合预期；库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求pooling后进行IlluminaPE150测序；
LncRNA序列对比及分析方法为：获得原始数据后，对原始数据进行过滤：去除带接头序列；去除无法确定碱基信息大于0.2％序列；去除单端序列含50％以上低质量碱基序列，分析可用序列，筛选出与参考基因组对比后有效数据，对对比率进行统计；
筛选差异表达LncRNA的方法为：RNA-seq的基因表达水平用FPKM表示，计算各样本所有基因或转录本的表达值后，通过盒形图展示不同样本基因或转录本表达水平的分布情况，通过所有样本的表达矩阵，进行基因或转录本水平的表达差异显著性分析，寻找与处理组相关的功能基因或转录本，使用pvalue＜0.05且|log2FoldChange|＞1作为差异显著性标准；
LncRNA靶基因功能预测及分析方法为：对比蛋白编码基因与LncRNA的位置关系和表达相关性预测LncRNA靶基因，对差异表达LncRNA的靶基因进行功能富集分析GO/KEGG预测LncRNA主要功能。
7.根据权利要求6所述新LncRNA，其特征在于，RNA的提取与检测方法为：
S1)利用液氮将需要使用的研钵预冷，分离组织至研钵中将其研磨成粉末状，取1～2g；
S2)将组织粉末移至有0.5～3mLTrizol离心管中，混匀，室温静置5min；
S3)加入0.2mL氯仿，混匀，静置5min，4℃离心15min；
S4)将上清液转移至离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，静置10min，4℃离心15min；
S5)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入75％乙醇，混合均匀，4℃离心5min；
S6)将步骤S5)重复一次；
S7)移去上清液后静置3分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-80℃保存；
S8)RNA完整性检测：将5μLRNA与1μLRNALoadingbuffer混匀，取5μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V5min后紫外凝胶成像系统观察拍照；
S9)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-80℃保存。
8.根据权利要求5所述新LncRNA，其特征在于，对筛选出的LncRNA进行进一步筛选的方法为：
1)引物设计与合成
根据测序数据原始序列，设计LncRNA荧光定量引物；以猪的GAPDH基因作为LncRNA内参，各基因号及引物序列见表4；
2)RNA提取与检测
S1)利用液氮将需要使用的研钵预冷，分离组织至研钵中将其研磨成粉末状，取0.5～5g；
S2)将组织粉末移至有0.5～3mLTrizol的离心管中，混匀，室温静置2～8min；
S3)加入0.1-0.5mL氯仿，混匀，静置2～8min，2～6℃离心10～20min；
S4)将上清液转移至离心管中，加入0.2～0.8mL异丙醇，混匀，静置5～15min，2～6℃离心10～20min；
S5)移去上清，保留离心管白色沉淀，加入65-80％乙醇，混合均匀，2～6℃离心2～8min；
S6)将步骤S5)重复一次；
S7)移去上清液后静置1～5分钟，晾干RNA沉淀至半透明状，加入10～50μL无酶水，吹打溶解RNA沉淀，得到的RNA可检测其完整性、浓度或存于-70～-85℃保存；
S8)RNA完整性检测：将2～8μLRNA与0.5～1.5μLRNALoadingbuffer混匀，取3～8μL混样进行琼脂糖凝胶电泳，120V2～8min后紫外凝胶成像系统观察拍照；
S9)RNA浓度检测：紫外分光光度计检测提取的RNA浓度以及在260～280nm处的吸光度，对合格的RNA定量、分装后置-70～-85℃保存；
3)cDNA合成
对定量后的RNA进行逆转录，逆转录后的cDNA置于-20℃保存，反应体系和条件见表5；
4)差异表达LncRNA的验证
从筛选出的差异表达LncRNA中随机选择出LncRNA，利用qRT-PCR对测序结果进行验证，将合成的引物稀释至10nM，以逆转录的cDNA为模板，反应体系采用10μL，包含SYBRGreenqPCRMasterMix5μL、10μM的正向引物0.75μL、10μM的反向引物0.75μL、cDNA模板1μL、RNase-freeH2O2.5μL，反应条件采用两步法PCR扩增标准程序，包括95℃预变性5min；95℃变性10s，退火30s，共40个循环；
5)数据统计与分析
计算皮下脂肪组织中目的LncRNA和内参基因mRNA表达量，计算各性状参数，分析各性状间相关性,结果以“平均数±标准差”表示。
9.一种如权利要求1所述新LncRNA的功能鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)LncRNA真核表达载体的构建
S1)引物设计及PCR扩增
设计其克隆引物，先以柯乐猪皮下脂肪组织cDNA为模板，通过普通PCR反应，扩增出长度为810bp目的片段全长；设计基因引物，扩增引物、反应体系和程序分别见表7、表8和表9；
S2)产物纯化及载体连接
S2.1)将PCR产物全部加入到提前配制好的1％琼脂糖凝胶板中进行琼脂糖电泳；
S2.2)利用凝胶成像系统，将目的条带切下并装入离心管中；
S2.3)向离心管中加入300～500μLBufferDE-A，将离心管放置于65～85℃水浴锅中加热，摇晃，直到凝胶完全融化；
S2.4)完全融化后向离心管中加入150～250μL的BufferDE-B然后充分混匀，然后将混液全部转移到制备管中,室温离心20～40s，弃掉离心管中的滤液；
S2.5)向制备管中加入400～600μL的BufferW1，室温离心20～40s，弃掉滤液，并将制备管放回离心管中；
S2.6)向制备管中加入600～800μL的BufferW2，室温离心20～40s，弃掉滤液，然后再重复一次；
S2.7)室温离心1～3min，去掉离心管中的残留液体，室温放置1～3min；
S2.8)将制备管放入新的0.5～2.0mL离心管中，向制备膜的中间加放入50～70℃的水浴锅加热的洗涤液25～35μL，室温静止放置1～3min，离心0.5～2min，滤液即为纯化后的产物，将离心管取出，放于-15～-25℃冰箱备用；
S2.9)载体连接，连接方法如表10；
3)产物转化
S1)将质粒浓度在100ng/ul左右的质粒吸取1-3ul加入到80～120μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置2～4min；
S2)38～43℃水浴70～110s；
S3)冰浴中放置1～5min；
S4)每管中加入500-800μl37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm/min温和振荡35～45min；
4)菌液PCR鉴定
S1)制备含相应抗性的琼脂平板；
S2)取100μl菌液,然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养10～15min；
S3)倒置平板于37℃培养12-16h可出现菌落；
S4)平板挑菌，37℃250rpm/min摇菌10～16h，用菌液进行PCR鉴定，PCR扩增，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer3ul，ddH2O14μL，循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min，将阳性克隆菌液送测序；测序比对正确的质粒，用HindIII-XhoI进行双酶切；
5)无内毒素质粒提取
在25mLLB液体培养基中加入60μL连接并转化成功的菌液、25μL氨苄抗生素，37℃摇菌过夜，步骤如下：
S1)吸取6～10mL过夜培养的菌液，加入离心管中，4℃离心0.5-1.5min，移去上清，保留沉淀；
S2)在上述留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1,P1中提前加入RNaseA，使用移液器吹打，制成悬浮菌液；
S3)向离心管中加入500μL溶液P2，摇晃7～15s，使菌体基本裂解；
S4)加入700μL溶液P3，翻转7～15s，充分混匀，4℃离心8～12min；
S5)收集上清液分次加入吸附柱CP4中，4℃离心0.5～1.5min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；
S6)向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，4℃离心0.5～1.5min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中；
S7)将步骤S6)重复操作一次；
S8)将吸附柱CP4放回收集管中，4℃离心1～4min；
S9)将上述吸附柱放入无酶离心管中，往吸附膜的中间悬空滴加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2～8min，4℃离心1～3min；
S10)用紫外分光光度计检测提取的无内毒素质粒浓度与纯度；
6)猪皮下脂肪细胞的复苏、传代及冻存
S1)细胞复苏
S1.1)从液氮或-80℃冰箱取出冻存的细胞，37℃水浴解冻；
S1.2)将解冻后细胞混合液移入10mL离心管，离心8～12min；
S1.3)弃培养基上清，留细胞沉淀，加入适量10％完全培养基吹打成细胞悬液，将离心管中悬液转移至细胞培养瓶中，用10％细胞完全培养基将瓶中培养液补足至5mL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；
S2)细胞传代
S2.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗2～4次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2～3min；
S2.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL10％细胞完全培养基终止消化；
S2.3)细胞悬液以1:2比例分瓶，用10％细胞完全培养基将瓶中培养液补足至5mL，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养；
S3)细胞冻存
S3.1)当细胞生长汇合度达到90％时，弃培养基，用含双抗的PBS清洗2～4次，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃恒温摇床中100rpm/min消化2～3min；
S3.2)当培养瓶中的细胞完全脱落下来后加入1mL10％细胞完全培养基终止消化；
S3.3)将培养瓶中悬液移至离心管中，离心5～15min，移弃培养基上清；
S3.4)在上述离心管中加入100μLDMSO和900μL胎牛血清，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张雄，史开志，王婧，张静，杜春林，赵春萍，
申请(专利权)人：贵州省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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