一种巴那沉香组织培养方法技术

本发明专利技术公开了一种巴那沉香组织培养的方法：(1)选择外植体；(2)外植体清洗及消毒；(3)接种及培养；(4)增殖培养；(5)生根培养；(6)炼苗移栽，直至移栽苗长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的巴那沉香植株。本发明专利技术系统研究植物营养组分对巴那沉香组培苗生长的影响，全面改进培养基组分和含量，培养基中额外添加了核黄素、泛酸钙、抗坏血酸、L‑半胱氨酸和叶酸。其中核黄素和抗坏血酸不仅是有机成分，还起到了减少褐化的作用；本培养方法更适合巴那沉香组织培养试管苗生长，培养所得的巴那沉香组培苗生长健壮，增殖率和生根率高，为巴那沉香规模化生产提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种巴那沉香组织培养方法
本专利技术属于植物细胞工程
，具体涉及一种巴那沉香组织培养方法。
技术介绍
巴那沉香(Aquilariabanaensis)是瑞香科沉香属植物，是一种热带亚热带常绿乔木，天然分布于越南的丘陵和山地，是东南亚国家生产沉香木和沉香油的主要树种。由于过度砍伐，该树种在许多天然林中已濒临灭绝。人工栽培巴那沉香是解决巴那沉香紧缺的最有效的方法，近年来广东、广西等地从越南引种栽培，但仍然面临种苗不足的问题。目前，尚未有通过组织培养进行巴那沉香繁殖的报道。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术问题，专利技术一种巴那沉香组织培养的方法，旨在得到一种生长健壮、增殖率和生根率高的巴那沉香组培苗的方法。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：一种巴那沉香组织培养的方法，包含以下操作步骤：(1)选择外植体：选择成年巴那沉香当年新生健壮无病虫害、半木质化带芽茎段为外植体，在连续日照5天以上(无阴雨天)晴朗的天气进行采集，用干净剪刀剪下；(2)外植体清洗及消毒：将步骤(1)中采集所得外植体茎段去掉叶片，用清水洗净表面灰尘，用洗衣粉溶液浸泡10分钟并用软毛笔仔细刷洗，尤其注意分枝处缝隙，清水漂洗干净后用流水冲洗30分钟以上，转入超净台，放入酒精中浸泡15～30s，无菌水清洗2次，再将所述外植体放入浓度为0.1％的氯化汞溶液中，加入1～2滴吐温80(聚山梨酯-80)，期间不停的摇晃，浸泡6～8min，无菌水清洗5～6次，即消毒完成；(3)接种及培养：将步骤(2)中消毒完成的外植体的两端切口处切除少量，避免伤口褐化严重，将外植体茎段切成至少带一个腋芽的短茎段，竖直插入启动培养基中，进行初代启动培养，启动培养基为改良B5培养基中添加0.1～0.2mg/L6-BA、0.05～0.1mg/LNAA和30g/L蔗糖，启动培养时间为30～40d；(4)增殖培养：将步骤(3)中启动培养过程中萌出的侧芽小心切下，转接到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基为改良B5培养基中添加0.2～0.4mg/L6-BA、0.1～0.2mg/LNAA和30g/L蔗糖，增殖培养30～35d后，获得增殖生长的芽苗；(5)生根培养：待步骤(4)中增殖培养产生的组培苗生长到1.5cm以上时，逐个切下，竖直转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养基为改良B5培养基中添加0.8～1.5mg/LIBA、0.1-0.2mg/LNAA、0.1-0.3mg/LIAA和20g/L蔗糖，生根培养30～35d，获得生根的巴那沉香组培苗；(6)炼苗移栽：将步骤(5)中获得的生根巴那沉香组培苗移出组培室，置于室外遮阴炼苗8-10d，然后打开盖子，向培养基注入适量无菌水保湿，继续遮阴炼苗，5d后将巴那沉香组培苗移出，移出时切忌不能直接拔取，而要先捏碎根系周围培养基后，用清水小心漂洗干净残留的培养基，将巴那沉香组培苗用0.05％高锰酸钾浸泡10min，移栽至0.1％多菌灵喷洒消毒过的基质(果园土：蛭石：珍珠岩＝4:1:1)中，移栽前几天注意遮阴保湿，每天喷灌一次，直至移栽苗长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的巴那沉香植株。优选的是，步骤(3)中所述启动培养的过程包括暗培养和光培养，所述暗培养的时间为7～10d，所述光培养的时间为23～33d，总时长30～40d；所述光培养的光照强度2000～2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为60％。优选的是，步骤(4)中所述的增殖培养和步骤(5)中所述的生根培养过程都包括暗培养和光培养，所述暗培养的时间皆为6～8d，所述光培养的时间皆为24～32d，总时长皆为30～35d；所述光培养的光照强度为2000～2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为60％。优选的是，所述启动培养基、增殖培养基、生根培养基的基本培养基是改良的B5培养基，所述改良的B5培养基各组分及含量如下：大量元素：KNO32000mg/L，(NH4)2SO4134mg/L，NaH2PO4200mg/L，MgSO4·7H2O250mg/L，CaCl2·2H2O200mg/L；微量元素：KI0.75mg/L，H3BO33.0mg/L，MnSO4·4H2O15mg/L，ZnSO4·7H2O5mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L；CuSO4·5H2O0.025mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，FeSO4·7H2O(27.8mg/L)+Na2-EDTA·2H2O(37.3mg/L)；有机成分：肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)1.0mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1)5mg/L，甘氨酸2mg/L，核黄素(维生素B2)10mg/L，泛酸钙1.1mg/L，抗坏血酸10mg/L，L-半胱氨酸5mg/L，叶酸0.2mg/。优选的是，所述启动培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基的pH均为5.8～6.0；均为以琼脂为支撑物的固体培养基，所述琼脂的添加量为5.8～6.3g/L。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术系统研究植物营养组分对巴那沉香组培苗生长的影响，全面改进培养基组分和含量，培养基中额外添加的核黄素、泛酸钙、抗坏血酸、L-半胱氨酸和叶酸。其中，核黄素和抗坏血酸不仅是有机成分，还起到了减少褐化的作用；本培养方法更适合巴那沉香组织培养试管苗生长，培养所得的巴那沉香组培苗生长健壮，增殖率和生根率高，为巴那沉香规模化生产提供技术支撑。具体实施方式下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。下列实施例中使用的改良的B5培养基各组分及含量如下：大量元素：KNO32000mg/L，(NH4)2SO4134mg/L，NaH2PO4200mg/L，MgSO4·7H2O250mg/L，CaCl2·2H2O200mg/L；微量元素：KI0.75mg/L，H3BO33.0mg/L，MnSO4·4H2O15mg/L，ZnSO4·7H2O5mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L；CuSO4·5H2O0.025mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，FeSO4·7H2O(27.8mg/L)+Na2-EDTA·2H2O(37.3mg/L)；有机成分：肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)1.0mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1)5mg/L，甘氨酸2mg/L，核黄素(维生素B2)10mg/L，泛酸钙1.1mg/L，抗坏血酸10mg/L，L-半胱氨酸5mg/L，叶酸0.2mg/；其中，核黄素，泛酸钙，抗坏血酸，L-半胱氨酸，叶酸为本培养方法额外添加的有机成分，其中核黄素和抗坏血酸不仅是有机成分，还起到了减少褐化的作用，在本培养方法中作用非常关键；培养基的pH均为5.8～6.0，以琼脂为支撑物的固体培养基，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种巴那沉香组织培养种苗的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：/n(1)选择外植体：选择巴那沉香半木质化带芽茎段为外植体，在连续日照5天以上晴朗的天气进行采集；/n(2)外植体清洗及消毒：将步骤(1)中采集所得外植体茎段去掉叶片，用洗衣粉溶液浸泡10分钟并刷洗，漂洗干净后冲洗30分钟以上，转入超净台，放入酒精中浸泡15～30s，无菌水清洗2次，再将所述外植体放入浓度为0.1％的氯化汞溶液中，加入1～2滴吐温80，期间不停的摇晃，浸泡6～8min，无菌水清洗5～6次，即消毒完成；/n(3)接种及培养：将步骤(2)中消毒完成的外植体的两端切口处切除，将外植体茎段切成至少带一个腋芽的短茎段，竖直插入启动培养基中，进行初代启动培养，启动培养基为改良B5培养基中添加0.1～0.2mg/L 6-BA、0.05～0.1mg/L NAA和30g/L蔗糖，启动培养时间为30～40d；/n(4)增殖培养：将步骤(3)中启动培养过程中萌出的侧芽切下，转接到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基为改良B5培养基中添加0.2～0.4mg/L 6-BA、0.1～0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖，增殖培养30～35d后，获得增殖生长的芽苗；/n(5)生根培养：待步骤(4)中增殖培养产生的组培苗生长到1.5cm以上时，逐个切下，竖直转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养基为改良B5培养基中添加0.8～1.5mg/LIBA、0.1-0.2mg/L NAA、0.1-0.3mg/L IAA和20g/L蔗糖，生根培养30～35d，获得生根的巴那沉香组培苗；/n(6)炼苗移栽：将步骤(5)中获得的生根巴那沉香组培苗置于室外遮阴炼苗8-10d，培养基保湿，继续遮阴炼苗，5d后将巴那沉香组培苗移出，移出时先捏碎根系周围培养基后，用水漂洗干净残留的培养基，将巴那沉香组培苗用0.05％高锰酸钾浸泡10min，移栽至0.1％多菌灵喷洒消毒过的基质中，每天喷灌一次，直至移栽苗长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的巴那沉香植株。/n...

【技术特征摘要】
1.一种巴那沉香组织培养种苗的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：
(1)选择外植体：选择巴那沉香半木质化带芽茎段为外植体，在连续日照5天以上晴朗的天气进行采集；
(2)外植体清洗及消毒：将步骤(1)中采集所得外植体茎段去掉叶片，用洗衣粉溶液浸泡10分钟并刷洗，漂洗干净后冲洗30分钟以上，转入超净台，放入酒精中浸泡15～30s，无菌水清洗2次，再将所述外植体放入浓度为0.1％的氯化汞溶液中，加入1～2滴吐温80，期间不停的摇晃，浸泡6～8min，无菌水清洗5～6次，即消毒完成；
(3)接种及培养：将步骤(2)中消毒完成的外植体的两端切口处切除，将外植体茎段切成至少带一个腋芽的短茎段，竖直插入启动培养基中，进行初代启动培养，启动培养基为改良B5培养基中添加0.1～0.2mg/L6-BA、0.05～0.1mg/LNAA和30g/L蔗糖，启动培养时间为30～40d；
(4)增殖培养：将步骤(3)中启动培养过程中萌出的侧芽切下，转接到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基为改良B5培养基中添加0.2～0.4mg/L6-BA、0.1～0.2mg/LNAA和30g/L蔗糖，增殖培养30～35d后，获得增殖生长的芽苗；
(5)生根培养：待步骤(4)中增殖培养产生的组培苗生长到1.5cm以上时，逐个切下，竖直转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养基为改良B5培养基中添加0.8～1.5mg/LIBA、0.1-0.2mg/LNAA、0.1-0.3mg/LIAA和20g/L蔗糖，生根培养30～35d，获得生根的巴那沉香组培苗；
(6)炼苗移栽：将步骤(5)中获得的生根巴那沉香组培苗置于室外遮阴炼苗8-10d，培养基保湿，继续遮阴炼苗，5d后将巴那沉香组培苗移出，移出时先捏碎根系周围培养基后，用水漂洗干净残留的培养基，将巴那沉香组培苗用0.05％高锰酸钾浸泡10min，移栽至0.1％多菌灵喷洒消毒过的基质中，每天喷灌一次，直至移栽苗长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的巴那沉香植株。


2.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔梦吉，符韵林，李英健，韦鹏练，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45