本发明专利技术公开了一种检测卡那霉素的适配体胶体金侧向层析试纸，属于分析化学、医药、环境、食品安全、纳米生物传感等领域。本发明专利技术利用AuNPs@polyA‑DNA能够快速、灵敏的捕获DNA的互补序列(Aptamer和CapApt)，开发出快速、灵敏、低成本的胶体金侧向层析试纸条。试纸条法检测卡那霉素简便快速，可随时抵检测，只需要将样品口中加入测试溶液，5min以后试纸条显色完全，即可观察实验结果，可以大幅度的提高检测效率。用肉眼进行定性分析，使用胶体金试纸定量分析仪进行定量分析。对食品中卡那霉素残留检测具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种检测卡那霉素的适配体胶体金侧向层析试纸
本专利技术涉及一种检测卡那霉素的适配体胶体金侧向层析试纸，属于分析化学、医药、环境、食品安全、纳米生物传感等领域。
技术介绍
抗生素是细菌、真菌、动物或植物产生的次级代谢产物，具有多种抗病原体活性。其中，卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，由于其水溶性强、对许多革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有广谱抗菌作用以及价格便宜和用药方便等优点，被广泛应用于兽药和饲料添加剂。然而，抗生素的过度使用会对人类健康和环境安全带来很大的问题。一般来说，抗生素的滥用会导致细菌耐药性的增加和其他副作用，如耳毒性、肾毒性等毒性作用，并对神经肌肉接头产生阻滞作用，引起过敏反应等，严重时会致人死亡。近年来，抗生素的滥用已经成为全球范围内一个严重的公共卫生问题。欧盟委员会明确规定牛奶中的卡那霉素的最高残留量为150μg/kg。为了保障食品的质量和安全，有必要建立简单、快速的卡那霉素的检测方法。现如今，用于检测卡那霉素残留的方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法、免疫分析法、荧光测定法和比色法等。这些传统的方法虽然能准确的检测卡那霉素，但大都需要专用的设备，并且操作复杂、易受干扰、灵敏度低、耗时长，导致其应用范围有限，不能设计成便携式设备来实现现场检测。因此，建立一种快速、特异灵敏的卡那霉素等抗生素残留的现场检测具有重要意义。核酸适配体是一种经过体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX)，得到的一小段结构化的寡核苷酸序列(RNA或DNA)，可以与相应的靶标分子(蛋白质，病毒，细菌，细胞，重金属离子等)进行高亲和力和强特异性的结合，为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台。基于核酸适配体标记的胶体金侧向层析试纸，具有长期稳定、检测时间短、成本低、操作简单、快速等优点，是现场快速检测多种目标物的理想方法。现有核酸适配体胶体金侧向层析试纸条的设计，通常应用巯基化核酸-胶体金偶联物作为标记物。该标记物探针的核酸负载量较高，其在核酸链杂交过程中存在空间位阻，影响其在T线上的杂交速率。AuNPs@polyA-DNA偶联物的制备是基于polyA核酸单链在金纳米粒子(AuNPs)表面的特异性非共价吸附；相比巯基化单链DNA修饰的AuNPs，该偶联物中单链DNA负载量显著降低，单链DNA空间位阻小，可显著提高AuNPs-DNA偶联物的杂交速度(JournaloftheAmericanChemicalSociety,2012,134(29):11876-9.)。目前，基于适配体识别卡那霉素的胶体金侧向层析试纸研究较少，在文献(Analyst,2018,143(1):182-189.)中，以卡那霉素适配体修饰的金纳米粒子(AuNPs-Apt)为探针，并且利用DNA1修饰银纳米粒子(AgNPs-DNA1)作为信号放大元件。通过DNA1和适配体的互补序列，可以得到AgNP-DNA1-Apt-AuNPs复合物，将其做为分子信标，可在10min内完成卡那霉素的检测，肉眼检测限为35nM。该试纸条需要AgNPs-DNA1放大元件，试纸条的结构较为复杂，不利于产品的稳定生产和应用的重复性。
技术实现思路
[技术问题]现有的卡那霉素核酸适配体胶体金侧向层析试纸条采用信号放大方法，设计较复杂，成本较高，基于简单设计且达到高灵敏性能具有挑战性。[技术方案]本专利技术提供一种设计简单且达到高灵敏性能的试纸条，采用竞争结合模式检测小分子(本专利技术中为卡那霉素与AuNPs@polyA-DNA探针竞争结合卡那霉素适配体)，降低竞争分子(本专利技术为适配体)用量，有利于提高检测目标物(本专利技术为卡那霉素)灵敏度。本专利技术采用AuNPs@polyA-DNA偶联物作为探针，可显著降低了适配体用量，从而实现快速灵敏的定性或定量检测卡那霉素，肉眼检测限达到15ng/mL。本专利技术提供一种基于适配体和AuNPs@polyA-DNA偶联物的胶体金侧向层析试纸条检测卡那霉素，该试纸条一般是由样品垫、结合垫(金标垫)、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫和PVC胶板组成。所述试纸条的检测原理为：采用竞争法检测卡那霉素，当样品溶液中不含卡那霉素时，卡那霉素的适配体与AuNPs@polyA-DNA探针结合在检测区域(T线)被CapApt捕获形成AuNPs@polyA-DNA-Apt-capApt复合物，由于AuNPs的积累，在检测区可以观察到一个清晰地深红色带，检测结果为阴性。当样品溶液中含有卡那霉素时，卡那霉素与卡那霉素适配体结合，使卡那霉素适配体不能与AuNPs@polyA-DNA探针结合，从而在检测区域(T线)不能捕获AuNPs@polyA-DNA探针，检测线上AuNPs的积累减少，检测线较浅或不显色，检测结果为阳性。检测区域上的颜色强度与卡那霉素的浓度呈负相关。无论样品溶液中是否含有卡那霉素，AuNPs@polyA-DNA探针都可以在控制区域(C线)被CapDNA捕获。本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测卡那霉素的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术第二个目的是提供上述核酸适配体在制备卡那霉素检测试剂盒中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种胶体金侧向层析试纸条，所述试纸条含有上述核酸适配体和AuNPs@polyA-DNA偶联物。在一种实施方式中，所述核酸适配体的序列如SEQIDNO.1所示。在一种实施方式中，所述AuNPs@polyA-DNA偶联物是将序列如SEQIDNO.2所示的polyA-DNA和纳米金离子(AuNPs)偶联得到的。在一种实施方式中，所述AuNPs的粒径为13～17nm；所述polyA-DNA的浓度为80～120μM。在一种实施方式中，所述试纸条包括样品垫、结合垫(金标垫)、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫和PVC胶板；所述PVC底板上依次黏贴样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫；所述NC膜上依次设有检测区和控制区，且检测区和控制区之间的距离为4～6mm；所述检测区上有链霉亲和素-生物素-capApt，控制区上有链霉亲和素-生物素-capDNA；所述金标垫上含有AuNPs@polyA-DNA偶联物。在一种实施方式中，所述样品垫与金标垫间重叠部位长度为1～2mm，样品垫置于金标垫上方；金标垫与NC膜间重叠部位长度为1～2mm，金标垫置于NC膜上方；NC膜与吸水垫间重叠部位长度为1～3mm，吸水垫置于NC膜上方。在一种实施方式中，所述链霉亲和素-生物素-capApt与链霉亲和素-生物素-capDNA是将链霉亲和素分别与3’端连有生物素的capApt和5’端连有生物素的capDNA等体积混合，在4℃孵育1h制备得到的。在一种实施方式中，所述链霉亲和素浓度为2.5mg/mL，所述capApt和capDNA浓度为250μM。在一种实施方式中，所述capApt的核苷酸序列如SEQIDNO本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测卡那霉素的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如SEQID NO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于检测卡那霉素的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的核酸适配体在制备卡那霉素检测产品中的应用。
3.一种胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，含有AuNPs@polyA-DNA偶联物和权利要求1所述的核酸适配体。
4.根据权利要求3所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述AuNPs@polyA-DNA偶联物是将序列如SEQIDNO.2所示的polyA-DNA和纳米金离子偶联得到的。
5.根据权利要求4所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述纳米金离子的粒径为13～17nm；所述polyA-DNA的浓度为80～120μM。
6.根据权利要求3～5任一所述的胶体金侧向层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC胶板；所述PVC底板上依次黏贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述NC膜上依次设有检测区和控制区，且检测区和控制区之间的距离为4～6mm；所述检测区上有链霉亲和素-生物素-capApt，控制区上有链霉亲和素-生物素-capDNA；所述金...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭池方，常芮，李秀萍，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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