用于检测肺癌标志物的金纳米笼SERS传感器及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于同时检测两种肺癌标志物miR‑21和miR‑196a‑5p的金纳米笼SERS传感器的制备方法，该方法包括1)采集和处理尿液样本；2)利用一锅法制备金纳米笼(GNCs)；3)步骤2)制备得到的金纳米笼的表面分别标记拉曼信号分子4‑MBA和DTNB，接着分别修饰生物素标记的发卡H1‑bio‑1和H1‑bio‑2，形成两种SERS标记；4)设计并构建了基于催化发卡自组装(CHA)信号放大的试纸条传感器。本发明专利技术具有灵敏度高、特异性强、组装过程简单、检测速度快等优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测肺癌标志物的金纳米笼SERS传感器及其制备方法
本专利技术属于材料
，涉及一种SERS传感器及其制备方法，尤其涉及一种用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器及其制备方法。
技术介绍
肺癌的发病率及病死率近年来逐渐上升，肺癌已成为全球死亡率最高的恶性肿瘤之一。据报道，2018年肺癌占确诊癌症病例总数的11.6％，占癌症死亡总人数的18.4％，这也是男性癌症死亡的主要原因。肺癌发展到晚期才会表现出明显的临床症状，大部分肺癌通常在无法手术的疾病晚期才被发现，导致患者生存率普遍较差。因此，通过各种方法进行肺癌的早期筛查十分必要。此外，发展出一种肺癌生物标志物定量分析的新方法是肺癌早期诊断和有效治疗的关键。由于单一生物标志物检测在高度复杂的病理环境下的特异性和敏感性较低，采用多个生物标志物同时检测以提高检出的效率和准确性，已成为当前肺癌诊断的关键。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码RNA，在多种生物过程的调控中发挥重要作用，包括肿瘤细胞的迁移、侵袭、转移和凋亡。最近有报道称miR-21在肺癌中是一种致癌miRNA，并且在肺癌中显著上调。在这种情况下，miR-21可以被视为检测肺癌的生物标志物。最近的一项研究表明，miR-196a-5p可能在肺癌进展中起到促进肿瘤的作用，并且miR-196a-5p在肺癌组织中显著上调。因此miR-196a-5p也可以作为肺癌检测的生物标志物。各种检测肿瘤相关miRNAs的策略和技术已经被开发出来，如实时聚合酶链反应(qRT-PCR)、Northern杂交法和DNA微阵列(基因芯片)。然而，由于以上这些方法操作复杂、设备成本高、需要专业的技术人员等原因，使其无法广泛应用于癌症诊断。因此，建立一种简便、快速、灵敏的检测miR-21和miR-196a-5p的方法在肺癌的早期筛选中具有重要意义。在检测平台中，免疫层析(LFA)因其简单、灵活、快速和低成本的优点成为快速筛查的有力工具。迄今为止，LFA已成功用于检测病毒、抗原、蛋白质等物质。但这些LFA试纸灵敏度低，只能提供分析物浓度的定性或半定量结果，限制了其应用。更重要的是，它们通常受到血液成分敏感性差和严重干扰的影响。为了解决这些问题，有必要寻找一种新的定量分析方法。基于SERS的LFA检测方法就是其中之一。表面增强拉曼光谱(SERS)是一种基于分子在粗糙金属表面吸附的光谱技术，与传统的免疫分析相比，SERS具有相当大的优势。首先，SERS由于其指纹特征，在复杂的样品系统中对分子具有较好的检测精度；其次，SERS具有良好的稳定性和便利性，可以对拉曼信号进行高强度的放大和量化。“热点”可以通过蛋白质和其他分子在纳米颗粒表面的积累而增加。由于电磁和化学的影响，SERS信号在“热点”处大大增强，使得SERS信号比传统的拉曼光谱高出10-14个数量级。因此，SERS被广泛应用于各种分析应用中。基于SERS技术的这些优势，SERS-LFA有望克服传统的SERS技术灵敏度低、测量精度低的问题。已有文献报道，利用SERS-LFA对缓冲液中的蛋白质和核酸进行检测，并取得了丰硕成果。SERS与LFA的结合，使检测条生物传感器能够进行定量检测，在一定程度上提高了检测灵敏度。但对于一些低浓度的靶点，仍不能满足超灵敏检测的要求，因此引入信号放大策略迫在眉睫。催化发卡自组装(CHA)是一种新型的miRNA信号放大手段，无需酶催化，在室温下无需扩增设备即可进行。在CHA反应中，两条发卡DNA互补，嵌入到茎环内的互补区域限制了其自发杂交，使它们在溶液中可以稳定存在。当有引发链存在时，支点会引发链置换反应，打开其中一条DNA链的发卡结构，进而引发两条发卡DNA链的组装，置换出来的miRNA继续引发下一轮杂交反应，从而使检测信号得到放大。SERS检测miR-21和miR-196a-5p的技术真正走入临床应用还面临诸多需要解决的难题。首要问题是制备表面增强性能优异便于使用、易于制备、均一且可重复性好，具有较好的生物相容性的SERS基底。具有中空内部和多孔壁的金纳米笼(GNCs)是一种新型的、极有前景的等离子体共振材料。由于腔体的内壁和穿透墙，GNCs在内壁和外壁之间具有优越的耦合电磁场，这是由于内外表面场的耦合，导致强烈的光吸收，拉曼信号增强。另一方面，GNCs中空的内部可以容纳更多的信号分子。此外，GNCs具有巨大的比表面积，可以为更多的信号分子提供更多的附着位点，导致强烈的信号增强，从而提高SERS的灵敏度。目前合成金纳米笼的方法相对复杂、所需时间长、所需成本高，发展一种简单快速方法仍是一项具有挑战性的工作。将金纳米笼基底的SERS效应和LFA检测方法相结合，用于miR-21和miR-196a-5p的研究在国内尚无相关报道。既往SERS对肺癌的研究多数集中在CEA、NSE、CK-19等蛋白质类相关指标，涉及miRNA相关的研究也鲜有报道。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的上述技术问题，本专利技术提供了一种灵敏度高、特异性强、组装过程简单、检测速度快的用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器及其制备方法。为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器，该传感器将金纳米笼基底的SERS效应和LFA检测方法相结合，用于miR-21和miR-196a-5p的检测。其次，本专利技术还提供了一种用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器的制备方法，具体包括以下步骤：(1)采集和处理尿液样本；(2)利用一锅法制备金纳米笼；(3)将步骤(2)制备得到的金纳米笼的表面分别标记拉曼信号分子4-MBA和DTNB，接着分别修饰生物素标记的发卡H1-bio-1和H1-bio-2，形成两种SERS标记；(4)设计并构建基于催化发卡自组装(CHA)信号放大的试纸条传感器；其中，步骤(1)的具体实现方式为：将尿液样本分为健康人群和NSCLC患者组，在早餐前采集3-10mL新鲜尿液，将获得的尿液样本立即冷冻保存；其中，步骤(2)的具体实现方式为：将1-5mLHAuCl4溶液(0.5-1M)一次性加到不断搅拌的1-5mLHMT溶液(0.01-0.05M)中，接着将1-5mLPVP溶液(0.10-0.50M)和5-15μLAgNO3溶液(0.005-0.02M)加入混合溶液中，直到溶液变为无色透明，在持续搅拌10-60s后，加入5-20μLAA溶液(0.05-0.1M)继续搅拌约10-30min，上述混合溶液在室温下保存5-20h，最后将金纳米笼分别用乙醇和超纯水离心后分散在超纯水中，将金纳米笼溶液存放在4℃冰箱中待用，用于后续SERS标记的制备；其中，步骤(3)的具体实现方式为：(3)-1)在SERS标记合成过程中，使用4-MBA和DTNB作为拉曼信号分子，4-MBA和DTNB可以通过Au-S键偶联到金本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器，其特征在于，该传感器将金纳米笼基底的SERS效应和LFA检测方法相结合，用于miR-21和miR-196a-5p的检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器，其特征在于，该传感器将金纳米笼基底的SERS效应和LFA检测方法相结合，用于miR-21和miR-196a-5p的检测。


2.如权利要求1所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)采集和处理尿液样本；
(2)利用一锅法制备金纳米笼；
(3)将步骤(2)制备得到的金纳米笼的表面分别标记拉曼信号分子4-MBA和DTNB，接着分别修饰生物素标记的发卡H1-bio-1和H1-bio-2，形成两种SERS标记；
(4)设计并构建基于催化发卡自组装(CHA)信号放大的试纸条传感器。


3.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(1)具体包括如下步骤：
将尿液样本分为健康人群和NSCLC患者组，在早餐前采集3-10mL新鲜尿液，将获得的尿液样本立即冷冻保存。


4.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(2)具体包括如下步骤：
将1-5mL0.5-1M的HAuCl4溶液一次性加到不断搅拌的1-5mL0.01-0.05MHMT溶液中，接着将1-5mL0.10-0.50MPVP溶液和5-15μL的0.005-0.02MAgNO3溶液加入混合溶液中，直到溶液变为无色透明，在持续搅拌10-60s后，加入5-20μL的0.05-0.1MAA溶液继续搅拌约10-30min，将得到的混合溶液在室温下保存5-20h，最后将金纳米笼分别用乙醇和超纯水离心后分散在超纯水中，将金纳米笼溶液存放在4℃冰箱中待用，用于后续SERS标记的制备。


5.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(3)具体包括如下步骤：
(3)-1)在SERS标记合成过程中，使用4-MBA和DTNB作为拉曼信号分子，4-MBA和DTNB可以通过Au-S键偶联到金纳米笼表面，将30-80μL1mM的4-MBA乙醇溶液加入到0.5-3mL步骤1)所合成的金纳米笼溶液中，搅拌10-50min后得到GNCs@4-MBA溶液溶液，然后用同样的方法获得DTNB标记的GNCs；
(3)-2)将10-30μL0.5mM的H1-bio-1与20-50μL新鲜制备的0.5-2mM的TCEP缓冲液混合1-3h，用于活化H1-bio-1；然后，将活化后的H1-bio-1与0.5-2mLGNCs@4-MBA溶液混合10-18h，得到了GNCs@4-MBA@H1-bio-1溶液；同时利用EDC和NHS作为偶联剂激活4-MBA和DTNB表面的-COOH，活化后的-COOH会与MIgG表面的-NH2结合；向上述溶液里加入20-50μL150mM的EDC溶液和20-50μL20-50mM的NHS溶液，接着加入50-200μL5-10μg/μL的MIgG溶液，接着在37℃下搅拌1-8h，最终制备得到GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG溶液；
(3)-3)接着加入2-20μL30-80μg/mL的牛血清白蛋白溶液，孵育0.5-3h，阻断羧基多余的结合位点，然后离心5-20min，加入用0.01MPBS缓冲液溶解的2-20μL的2-8MNaCl溶液，使NaCl溶液在混合溶液中的浓度逐渐变为0.2-1M，将沉淀溶解在PBS溶液中供进一步使用,最终得到两种SERS标记。


6.如权利要求5所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中H1-bio-1用H1-bio-2替代。


7.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(4)具体包括如下步骤：
(4)-1)本发明中使用的试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，在组装试纸条之前，样品垫需要预处理，在含0.1-0.4％TritonX-100的40-60mMTrisHCl溶液和100-200mMNaCl溶液中浸泡，然后在37℃的烘箱中干燥1-3h，然后，把上述样品垫切条带；
(4)-2)将2-5μL的SERS标记滴在共轭垫上，37℃烘干1-3h，其中，GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG和GNCs@DTNB@H1-bio-2@MIgG，比例为1:1；
(4)-3)将2-6μL0.01mM的H2-bio-1溶液，2-6μL0.01mM的H2-bio-2溶液和5-20μL0.3mg/mL的SA溶液喷点于测试线上形成T线，同样在NC膜控制线喷上1-3μLGMIgG形成C线，按照1:50稀释比例，接着将NC膜在37℃干燥10-60min；
(4)-4)最后将样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴到底板上，为了确保实验过程中缓冲液可以连续流动，每个相邻的部分都有1-3mm的重叠，制备好的试纸条放于4℃干燥处避光保存。


8.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(1)具体包括如下步骤：
尿液样本分为健康人群和NSCLC患者组，在早餐前采集5mL新鲜尿液，将获得的尿液样本立即冷冻并保存在-80℃冰箱里。


9.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(2)具体包括如下步骤：
将3mLHAuCl4溶液(0.75M)一次性加到不断搅拌的3mLHMT溶液(0.03M)中；接着将3mLPVP溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹小卫，孙悦，毛宇，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32