一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因及其应用，属于生物技术和农业应用领域。该RNAi的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，其获得的步骤如下：(1)提取蛴螬的总RNA，反转录获得cDNA第一链；(2)以步骤(1)中获得的cDNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增；(3)以步骤(2)中的PCR产物为模板，使用SEQ ID NO.3～6所示的引物进行PCR，获得合成dsRNA的正、反向模板；(4)反应完成后回收电泳产物，以回收的电泳产物为模板，转录合成dsRNA。注射或饲喂上述dsRNA72h后，蛴螬幼虫的HpCDA1沉默效率高于95％，死亡率高于90％。90％。90％。

A highly lethal RNAi target gene for grubs and its application

【技术实现步骤摘要】
一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术和农业应用领域，尤其涉及一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因及其应用。

技术介绍

[0002]蛴螬是国内外公认难防治的土栖性害虫，对农作物、果树和林木等造成严重危害。化学农药防治破坏了生态环境和作物品质，因此利用生物防治方法控制蛴螬危害成为必然，开发新的生物防治靶标的害虫治理策略成为研究热点。昆虫体壁是维护昆虫生长发育的重要防御系统，其中体壁中表皮层主要由几丁质和蛋白质组成，可作为杀虫药物的新型靶标。几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase，CDA)是几丁质代谢过程中的重要酶，可通过催化N
‑
乙酰氨基
‑
D
‑
葡萄糖胺(N
‑
acetyl
‑
b
‑
D
‑
glucosamine)脱去乙酰基将几丁质转变为壳聚糖，通过改变几丁质，破坏昆虫生长机制，是重要的生防靶标。
[0003]RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引发的内源特异性基因转录后沉默机制。dsRNA导入生物体内后，被细胞中称为Dicer的RNaseⅢ分解成21
‑
23bp的小干扰RNA(siRNA)，siRNA在沉默复合体(RISC)的作用下与目标mRNA结合，序列特异性地降解靶mRNA，阻止相应蛋白产物的合成，造成靶标基因的功能丧失。自从这种快速且直接沉默特定基因的机制被发现以来，RNAi技术迅速在非模式动物的基因功能研究领域得到广泛应用。RNAi作为一种基因功能研究的工具被大量应用，尤其是在遗传操作工具不完善的动植物中被广泛应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一在于提供一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因，该RNAi靶标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
[0005]该RNAi靶标基因的制备方法包括如下步骤：
[0006](1)提取蛴螬的总RNA，反转录获得cDNA第一链；
[0007](2)以步骤(1)中获得的cDNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR，获得chitin deacetylase1(HpCDA1)全长基因；
[0008](3)以步骤(2)中的PCR产物为模板，使用SEQ ID NO.3～6所示的引物进行PCR扩增，获得作为扩增dsRNA序列的正、反向模板；
[0009](4)反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，后回收电泳产物，以回收的电泳产物为模板，转录合成dsRNA，即获得RNAi靶标基因，该RNAi靶标基因由SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列组成。
[0010]进一步的，所述步骤(2)中的PCR反应体系为：25μL：2
×
PrimeSTAR Max Premix 12.5μL、10μmol/L上下游引物各1μL、模板1μL、无菌蒸馏水10.5μL。
[0011]进一步的，所述步骤(2)中的PCR反应条件为：95℃30s；95℃5s，55℃15s，72℃10s，35个循环。
[0012]进一步的，所述步骤(3)中PCR反应体系为：25μL：2
×
PrimeSTAR Max Premix 12.5μL、10μmol/L上下游引物各1μL、模板1μL、无菌蒸馏水10.5μL。
[0013]进一步的，所述步骤(3)中的PCR反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，45s，5个循环；95℃，30s；50℃，30s；72℃，45s，35个循环；72℃，10min。
[0014]本专利技术的目的之二在于提供所述RNAi靶标基因在蛴螬防控中的应用。
[0015]本专利技术的目的之三在于提供一种生物制品，其含有上述RNAi靶标基因。
[0016]进一步的，所述生物制品为注射式杀虫剂或饵剂。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0018]通过注射、饲喂蛴螬chitin deacetylase 1(HpCDA1)的dsRNA(即RNAi靶标基因)，统计摄入dsRNA后72h虫口死亡率以及基因沉默效率，以绿色荧光蛋白(GFP)为对照进行相同处理。结果显示，注射和饲喂dsRNA的蛴螬的HpCDA1基因沉默效率高于95％，虫口死亡率高于90％。本专利技术为蛴螬的生物防治提供了高效的靶标基因。
附图说明
[0019]图1为实施例2中注射dsGFP和dsHpCDA1 72h后蛴螬HpCDA1基因的相对表达量图。
[0020]图2为实施例2中注射dsHpCDA1 72h蛴螬形态图。
[0021]图3为实施例2中对照组dsGFP蛴螬形态图。
具体实施方式
[0022]实施例1
[0023]1.HpCDA1特异序列
[0024]将蛴螬几丁质脱乙酰酶基因HpCDA1基因序列提交GenBank，登录号为MG189704，基因长1593bp，编码530个氨基酸，预测蛋白分子量为60.1kDa，结构域分析结果显示HpCDA1包含几丁质结合区(ChBD)、低密度脂蛋白受体区(LDLa)和几丁质脱乙酰基催化区(CDA)。
[0025]2.HpCDA1基因特异序列扩增
[0026]根据序列信息，设计HpCDA1全长基因特异引物，引物序列如表1所示，其包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，可扩增出长度为1593bp的目的片段。
[0027]表1基因克隆特异引物
[0028][0029]3.供试昆虫饲养
[0030]蛴螬为河北农业大学植物保护学院昆虫生化与分子生物学实验室使用人工饲料饲养，饲养温度为26
±
1℃，相对湿度60
–
70％，光照16:8。
[0031]4.RNA的提取
[0032](1)提取蛴螬整虫总RNA，称量幼虫组织14mg，参照TIANGENRNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒说明书，提取其总RNA。具体提取RNA操作步骤如下：
[0033]①
匀浆处理：每10
‑
20mg组织加300μl裂解液RL(使用前请先检查是否已加入β
‑
巯
基乙醇)，用研磨杵将组织彻底研磨(如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器)；随后向匀浆液中加入590μl RNase
‑
Free ddH2O和10μl Proteinase K，混匀后56℃处理10
‑
20min。注意：组织量一定不要超过20mg，否则将导致RNA得率和质量下降。
[0034]②
12,000rpm(～13,400
×
g)离心2
‑
5min，取上清进行以下操作。
[0035]③
缓慢加入0.5倍上清体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因，其特征在于，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。2.根据权利要求1所述的RNAi靶标基因，其特征在于，所述RNAi靶标基因的制备方法包括如下步骤：(1)提取蛴螬的总RNA，反转录获得cDNA第一链；(2)以步骤(1)中获得的DNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增；(3)以步骤(2)中的PCR产物为模板，使用SEQ ID NO.3～6所示的引物进行PCR扩增，获得作为扩增dsRNA序列的正、反向模板；(4)反应完成后回收电泳产物，以回收的电泳产物为模板，转录合成dsRNA，即获得RNAi靶标基因，该dsRNA由SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列组成。3.根据权利要求2所述的RNAi靶标基因，其特征在于，所述步骤(2)中的PCR反应体系为：25μL：2
×
PrimeSTAR Max Premix 12.5μL、10μmol/L上下游引物各1μL、模板1μL、无菌蒸馏水10.5μL。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：赵丹，郭巍，康占海，陆秀君，李瑞军，刘兆瑞，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：